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생산세포주에 삽입된 레트로바이러스 벡터의 확인시험법 연구
Development of analysis method for integration site of retroviral vectors

  • 사업명

    식품의약품안전성관리

  • 과제명

    생산세포주에 삽입된 레트로바이러스 벡터의 확인시험법 연구

  • 주관연구기관

    (주)바이로메드

  • 연구책임자

    김수정

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2004-12

  • 과제시작년도

    2004

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016209

  • 과제고유번호

    1470000027

  • 키워드

    레트로바이러스 벡터.안전성 시험.삽입 위치 분석.삽입 돌연변이.retroviral vector.safety test.integration site analysis.insertional mutagenesis.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    The object of this research is to develop the analysis method for the integration site of retroviral vectors in the genome of tra...

    The object of this research is to develop the analysis method for the integration site of retroviral vectors in the genome of transduced cells. The unique feature of a retroviral vector is that it could integrate randomly into the genome of target cells, therefore there could be the possible side effects regarding this characteristic. The retroviral vector mediated gene transfer could possibly induce so called 'loss of function' by integrating within the essential genes or transactivate the proto-oncogene by integrating in the vicinity of the promoter of proto-oncogene. These two possibilities would finally cause the insertional mutagenesis. In this research, we developed the analysis method of integration pattern in order to investigate whether the transduced cells showed 'monoclonal expansion' and had carcinogenic potential. We set up the linear amplification-mediated (LAM)-PCR method which had been known to be most sensitive method for the detection of the integration of retroviral vectors. By using this method, we could analyze the patterns and the location of retroviral integration in the genome of the mouse blood cells which were derived from the infused bone marrow stem cells those were transduced with MT-gp91 retroviral vector. We analyzed the blood cells from around 20 mice after bone marrow transplantation (BMT) on every 2 months during the half years. The result of this analysis showed that the diversity of the integration site of retroviral vector was maintained and the monoclonal expansion was not observed in any mice analyzed for 6 months after BMT. In addition, we also developed the quantitative real time PCR method by which we could estimate the transduction efficiency of MT-gp91.


    본 연구는 레트로바이러스 벡터를 유전자치료제로 사용할 경우에 벡터가 전달된 세포의 염색체내에 삽입된 양상을 분석하는 법에 관한 연구이다. 레트로바이러스 벡터는 그 자체의 특성상 세포의 염색체내에 무작위로 삽입하는 특징을 가지고 있는...

    본 연구는 레트로바이러스 벡터를 유전자치료제로 사용할 경우에 벡터가 전달된 세포의 염색체내에 삽입된 양상을 분석하는 법에 관한 연구이다. 레트로바이러스 벡터는 그 자체의 특성상 세포의 염색체내에 무작위로 삽입하는 특징을 가지고 있는데, 이러한 특성과 관련된 부작용은 두 가지가 있을 수 있다. 첫째는 항종양 유전자등과 같은 정상적인 세포 유지에 필수적인 유전자 내부에 벡터가 삽입되어 해당 유전자의 발현을 불가능하게 하여 정상 생리 조절 과정을 할 수 없도록 하는 것이며, 둘째는 레트로바이러스 벡터가 유전자의 프로모터 부근에 삽입하여 레트로바이러스 벡터에 포함된 long terminal repeat (LTR)에 의한 비정상적인 유전자 발현을 유도할 수 있을 가능성이다. 이와 같은 레트로바이러스에 의한 세포의 비정상적인 변화로 유발될 수 있는 대표적인 것이 암화되는 것이며, 본 연구에서는 레트로바이러스 벡터 전달에 의해 세포의 암화가 일어나는지의 여부를 판단할 수 있는 기준을 개발하기 위하여 벡터의 염색체 내부의 삽입 양상을 분석하였다. 즉, 벡터 전달 후 숙주세포의 벡터 삽입 양상이 시간이 지남에 따라 한 종류로만 고정되는 지의 여부를 통하여 벡터가 전달된 한 종류의 세포만이 자라는 monoclonal expansion 여부를 판단하는 것이다. 이를 위하여 레트로바이러스 벡터 삽입 양상을 분석할 수 있는 방법을 확립하였다. 세포의 염색체에 삽입된 레트로바이러스 벡터의 위치를 분석할 수 있는 방법들 중 현재까지 가장 민감도가 높다고 알려진 linear amplification-mediated (LAM)-PCR법을 이용하였으며, 이를 통하여 레트로바이러스 벡터가 전달된 후의 세포의 염색체 내의 벡터 삽입 양상을 분석할 수 있었다. 그 이후에 위의 방법을 ex vivo 유전자치료 과정에 적용하여 in vivo에서 혈액세포내에 전달된 레트로바이러스 벡터의 삽입 양상이 어떻게 변화하는지 관찰하였다. 동물 모델로는 생쥐를 사용하였으며, donor 생쥐에서 골수줄기세포를 채취하여 MT-gp91 벡터로 트랜스덕션한 후 방사선을 조사한 recipient 생쥐에 이식하고, 2개월마다 recipient 생쥐에서 혈액을 채취하여 LAM-PCR을 수행하면서 벡터 삽입 양상을 관찰하였다. 골수 이식의 규모는 총 3 group으로 하여 20마리이상의 생쥐에 골수를 이식하여 분석하였다. 결과 분석시에 벡터 삽입 위치의 다양성이 얼마나 유지되고 있는가에 초점을 맞추었으며, 다양성의 유지 여부를 안전성을 판단할 수 있는 기준으로 삼았다. 총 관찰기간은 6개월으로 하였다. 또한 MT-gp91 retroviral vector의 전달 효율을 측정할 수 있는 real-time PCR법도 고안하여 골수줄기세포로의 유전자전달 효율도 측정하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 요약문 ...3
    4. Project Summary ...4
    5. 목차 ...5
    6. 제1장 서론 ...5
    7. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...6
    8. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...11
    9. 가. 연구내용 ...11...
    1. 연구결과보고서 ...1
    2. 제출문 ...2
    3. 요약문 ...3
    4. Project Summary ...4
    5. 목차 ...5
    6. 제1장 서론 ...5
    7. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...6
    8. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...11
    9. 가. 연구내용 ...11
    10. 나. 연구 결과 ...15
    11. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...22
    12. 가. 연구개발목표 달성도 ...22
    13. 나. 대외기여도 ...22
    14. 제5장 연구개발결과의 활용성과및 계획 ...23
    15. 가. 계량적 성과 ...23
    16. 나. 성과내용기술 ...23
    17. 다. 활용계획 ...23
    18. 제6장 기타 중요 변경사항 ...23
    19. 제7장 참고문헌 ...23
  • 참고문헌

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