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독성유전체기술을 이용한 diethylnitrosamine의 간독성 평가 연구
Application of toxicogenomics for hepatotoxicity study of diethylnitrosamine

  • 사업명

    독성유전체기술이용안전성평가기술개발

  • 과제명

    독성 유전체 기술을 이용한 안전성·유효성평가 기술개발

  • 주관연구기관

    한국화학연구원 부설 안전성평가연구소

  • 연구책임자

    이미가엘

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2004-11

  • 과제시작년도

    2004

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016322

  • 과제고유번호

    1470000930

  • 키워드

    마이크로어레이.디에틸니트로자민.병리조직학.유전자발현.독성유전체.microarray.diethylnitrosamine.histopathology.gene expression.toxicogenomics.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    In the present study, microarray analyses were performed with Affymetrix GeneChip in order to identify the gene-expression profil...

    In the present study, microarray analyses were performed with Affymetrix GeneChip in order to identify the gene-expression profiles for diethylnitrosamine (DEN), known as a hepatotoxin, and to provide valuable information for the evaluation of potential hepatotoxicity. DEN has been known to cause a variety of hepatocellular injuries including DNA damage with centribular cytotoxicity, resulting in liver cancer. Through the dose-range finding assay, the-no-observed-adverse-effect level (NOAEL) of DEN was determined to be 20 mg/kg. Thus, 2000 mg/kg was selected as the maximum dose in the main study. C57BL/6 mice were orally administered once with DEN at doses of 0, 3, 7 and 20 mg/kg. Animals were necropsied 2, 4, 8 and 24 hrs after the administration to remove the liver for gene expression and histopathologicals analysis, and to collect blood for serum biochemical analysis. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (AP) were measured using an autoanalyzer (Shimadzu CL-7200). No significant difference was observed in ALT, AST and AP in DEN-treated groups. The sections liver were stained with haematoxylin-eosin (H&E), PAS and reticulin for histopathological examination. Any kind of lesion related to DEN was not observed in all animals. For gene expression analysis. Labeled cRNA prepared from total RNA was hybridized to the Affymetrix Murine Genome 430A Array. Quality control parameters measured in GCOS software indicated that hybridizations were successfully performed. Self Organizing Map (SOM) clustering was performed using Data Mining Tool of Affymetrix for the selection of genes with significant gene expression changes. SOM clustering revealed that 13 and 11 genes were identified, including some unknown genes, whose expressions were dose-dependently decreased and increased, respectively, after 2 h treatment. Thirty six and twenty genes were markedly increased at the highest concentration after 4 h and 8 h treatment, respectively. The expression of twenty genes were found to be largely down-regulated after 24 h treatment. It is also observed that 46 and 30 genes were greatly down-regulated and up-regulated, respectively, at 20 mg/kg, which is the highest concentration used in this study. Especially, in order to identify the genes whose expressions are time-dependently changed at 20 mg/kg group, further analysis was performed. Eight genes were markedly down-regulated more than 10-fold and eight genes were up-regulated more than 5-fold. These included genes encoding Saa2 and Saa1 which are involved in acute-phase response and Clrf, which is associated with cellular defense response. Therefore, this study suggest that match with a toxicant signature can assigns a putative mechanism of action to the test compound if is established a database containing response patterns to various toxic compounds.


    본 연구에서는 간독성유발 물질로 널리 알려진 diethylnitrosamine에 의해서 조절되는 유전자 profile에 대한 정보를 확보함으로써 차후 간독성 물질의 screening system에 이를 이용하고자 하였다. dieth...

    본 연구에서는 간독성유발 물질로 널리 알려진 diethylnitrosamine에 의해서 조절되는 유전자 profile에 대한 정보를 확보함으로써 차후 간독성 물질의 screening system에 이를 이용하고자 하였다. diethylnitrosamine은 랫트의 간에서 centribular cytotoxicity와 더불어 DNA 손상을 유발하고 암을 유발하는 것으로 알려져 있는 물질이다. 용량설정시험을 통하여 간독성 병변이 관찰되지 않을 것으로 사료되는 20 mg/kg 농도군을 고농도로 설정하여 0, 3, 7, 20 mg/10 ml/kg로 본 시험을 수행하였다. 시험물질 투여후 2, 4, 8, 24시간 후 유전자 발현 분석과 병리조직학적 분석을 위하여 간 조직을 채취하였고, 혈액내의 효소활성도 측정을 위하여 심장천공법을 이용하여 혈액을 채취하였다. 혈액에서 분리한 혈청은 자동혈청생화학분석기 (Shimadzu CL-7200)를 이용하여 alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), alkaline phosphatase (ALP)를 측정하였다. 측정결과 각각의 수치에서 diethylnitrosamine 투여군과 부형제투여군사이에 유의성이 있는 차이는 관찰되지 않았다. 또한, Hematoxylin/Eosin(HE) 염색법과 PAS 염색, reticulin 염색법으로 염색한 간조직의 병리 관찰에서도 모든 투여용량 및 시간대에 관계없이 모두 정상 소견을 나타내었다. 유전자발현 분석을 위해서는 간으로부터 RNA를 추출하고 일련의 과정을 거쳐서 Murine Genome 430A Array (Affymetrix, USA)에 hybridization 하였다. GeneChip fluidics station (model 450)을 이용하여 microarray suite software에서 해당 protocol을 이용하여 실험을 수행하였고, GCOS 프로그램을 이용하여 모든 sample의 hybridization이 잘 수행되었음을 확인하였다. Data 분석은 Affymetrix사의 Data Mining Tool을 이용하여 Self Organizing Map (SOM) 분석등을 통해서 유의성 있게 변화하는 유전자 발현 패턴을 확인하였다. 동일 시간 내 농도군에 따른 유전자 발현 변화추이를 본 결과 2시간 처리군에서 농도군에 따라 유전자 발현이 감소한 유전자 13개와 증가한 유전자 11개를 발견하였다. 4시간 및 8시간 처리군에서는 고농도에서만 유전자 발현이 크게 증가한 유전자 36개와 20개를 관찰할 수 있었다. 24시간 처리군의 경우에는 고농도군에서 유전자발현이 크게 감소한 유전자 20개를 관찰할 수 있었다. 또한, 3단계 농도군중 간독성이 나타나기 시작하는 바로 아래 단계의 농도군인 20 mg/kg 투여군에서 4시간이후부터 현저하게 발현양이 감소하는 유전자를 각각 70개와 46개 발견하였다. 또한, 시간에 따라 발현양이 증가하는 유전자 30개를 발견 할 수 있었다. 특히, 최고용량인 20 mg/kg 투여군에서 시간에 따라 그 발현량이 크게 변화한 유전자군을 분석한 결과 acute-phase response에 관여하는 유전자(Saa2와 Saa1)등을 포함하는 8개의 유전자의 발현량이 10배 이상 감소하였고 cellular defense response에 관여하는 Clrf 유전자를 포함하는 8개의 유전자는 5배 이상 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 유전자군의 발현양 변화를 database화함으로써 미지의 물질에 대한 유전자 발현 결과와 비교를 통하여 시험물질이 간독성을 유발하는 물질인 지를 예측하는 데 사용할 수 있을 것으로 사료된다.


  • 목차(Contents) 

    1. 용역연구개발사업 연구결과보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 연구결과보고서 요약문 ...5
    5. Project Summary ...6
    6. 목차 ...7
    7. 제1장 서 론 ...8
    8. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...9
    9. 제1절 해외연구동향 ...9...
    1. 용역연구개발사업 연구결과보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 연구결과보고서 요약문 ...5
    5. Project Summary ...6
    6. 목차 ...7
    7. 제1장 서 론 ...8
    8. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...9
    9. 제1절 해외연구동향 ...9
    10. 제2절 국내연구동향 ...10
    11. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...12
    12. 제1절 시험방법 ...12
    13. 1. 시험계 및 사육환경 ...12
    14. 2. 용량설정시험 및 시험물질의 투여 ...12
    15. 3. 시료채취 ...12
    16. 제2절 연구내용 ...15
    17. 1. 유전자 발현 profile에 대한 정보 확보 ...15
    18. 2. 혈액생화학적 검사 ...15
    19. 3. 병리조직학적 검사 ...15
    20. 제3절 연구결과 ...15
    21. 1. 용량설정시험 ...15
    22. 2. 병리조직학적 검사 ...16
    23. 3. 혈액생화학적 검사 ...18
    24. 4. Hybridization을 위한 cRNA의 준비 ...20
    25. 5. Data analysis ...31
    26. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...62
    27. 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...63
    28. 제6장 기타 중요변경사항 ...64
    29. 제7장 참고문헌 ...65
    30. 총괄 연구과제 요약 ...66
  • 참고문헌

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