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보고서 상세정보

백신 첨가제 및 함유물질의 염증 반응을 통한 면역독성 평가기술개발 연구
Development of immunotoxicity assessments of Vaccine additives and containers using inflammation

  • 사업명

    식품의약품안전성관리

  • 과제명

    백신첨가제 및 함유물질의 염증 반응을 통한 면역독성 평가기술 개발

  • 주관연구기관

    조선대학교
    Chosun University

  • 연구책임자

    정혜광

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2004-11

  • 과제시작년도

    2004

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016393

  • 과제고유번호

    1470000126

  • 키워드

    백신 첨가제.백신 함유제.면역독성.평가기술개발.염증성 사이토카인.vaccine additives.vaccine containers.immunotoxicity.screening.inflammatory cytokines.iNOS.Cyclooxygenase-2.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    ${\cdot}$This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immunotoxicity o...

    ${\cdot}$This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immunotoxicity of vaccine additives and containers, especially for the identification of the effects of biomaterials, vaccine additives and containers, on the production of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2.
    ${\cdot}$This was accomplished using ovalbumin (OVA) and gelatin as a target molecules, those are thought as a useful for vaccine additives and containers. It was up to 100, 50 μg/ml of OVA or gelatin that was effective for the up-regulation of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2 in dose-dependent manner.
    ${\cdot}$By the result of the experiments to investigate the activity and the amount of COX-2, the production of $PGE_{2}$ and the transcriptional level of COX-2 were increased in dose-dependent manner after the treatment of OVA or gelatin into Raw 264.7 cells but the transcriptional level of COX-1 was not.
    ${\cdot}$The transactivity and DNA binding ability of NF-kB after the treatment of ovalbumin or gelatin were enhanced in dose-dependent manner by the results of transient transfection experiment and EMSA. From these results, the increment of NO production and transcriptional up-regulation of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2 could be induced by the activation of NF-kB in Raw 264.7 cells.
    ${\cdot}$The human COX-2 promoter regions were cloned into pGL3-basic vector containing luciferase reporter gene to investigate the DNA elements within COX-2 promoter region and the transcription factors involving in the transcriptional regulation of COX-2.
    ${\cdot}$The transcriptional regulation of COX-2 might be regulated by NF-kB and AP-1 after the treatment of OVA or gelatin in Raw 264.7 cells by the results of transient transfection experiment using deletion constructs and site-directed mutation constructs of COX-2 promoter and EMSA.
    ${\cdot}$Also, IgE and IgM increased in dose-dependent manner after the treatment of OVA or gelatin and activation of NK (natural killer) and LAK (lymphokine-activated killer) cell byvaccine additives and containers.
    ${\cdot}$Additionally, the production of $PGE_{2}$ in pouch fluid was increased in dose-dependent manner after the treatment of ovalbumin or gelatin into the pouch region of mouse.
    ${\cdot}$From these results, we could suggest that the analysis of $PGE_{2}$ amount produced by biomolecules in macrophage cells is useful as a primary screening method for evaluation of immunotoxicity of vaccine additives and containers.
    ${\cdot}$Quantitative analysis for immunotoxicity of biomaterials could be possible from the assessment of luciferase activity using COX-2 promoter reporter constructs. In addition, it is suggested that transcriptional regulation mechanism of COX-2 by biomaterials, vaccine additives and containers, could be identified deletion constructs and site-directed mutation constructs of COX-2 promoter.


    ${\cdot}$본 연구에서는 생균 백신과 사균 백신의 생산과정에서 백신의 안정성과 효과를 높이기 위해 첨가되는 첨가물질 (젤라틴)과 백신 제조 과정 중에 포함될 수 있는 함유물질 (ovalbumin)에 대한 면...

    ${\cdot}$본 연구에서는 생균 백신과 사균 백신의 생산과정에서 백신의 안정성과 효과를 높이기 위해 첨가되는 첨가물질 (젤라틴)과 백신 제조 과정 중에 포함될 수 있는 함유물질 (ovalbumin)에 대한 면역독성 평가 기술을 면역학적 염증 반응을 통해 개발하여, 백신 제품의 안전성을 분자적 수준에서 신속하게 검증 할 수 있는 면역독성 평가 방법을 개발하고자 하였다.
    ${\cdot}$면역독성을 평가하기 위해 면역의 가장 기본적인 위험신호의 하나인 염증을 평가 기준으로 선정하여, 염증과 직접적인 관련이 있는 염증성 cytokines과, iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase-2)의 발현 및 조절을 지표로 바이오제품 중 백신제조 시 첨가물질 및 함유물질의 영향과 그 작용기전을 평가할 수 있는 기술을 개발하고자 하였다.
    ${\cdot}$모델 물질로 삼은 ovalbumin (OVA)과 gelatin을 이용하여 염증관련 효소의 일종인 COX-2의 활성에 대한 영향을 macrophages 세포주인 Raw264.7 세포를 이용하여 COX-2에 의한 prostaglandin $E_{2}$($PGE_{2}$)의 생성량을 측정하였다. 그 결과 $PGE_{2}$의 생성양이 OVA 100 ㎍/㎖, gelatin 50 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 처리 농도 의존적으로 증가하였다.
    ${\cdot}$이러한 결과가 COX 유전자의 발현에 의한 것인지를 조사하기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과 OVA과 gelatin의 농도에 의존적으로 COX-2가 증가하였으며, COX-1 유전자의 발현은 변화가 없었다.
    ${\cdot}$면역독성의 다른 지표로 사용된 NO 및 염증성 cytokines과 iNOS에 대한 실험을 수행한 결과 OVA과 gelatin을 처리한 Raw264.7 세포에서 NO 생성의 증가와 iNOS, 염증성 cytokines의 생성이 농도 의존적으로 증가하는 것을 각각 RT-PCR과 ELISA 방법을 통해 확인 할 수 있었다. 이러한 염증관련인자들의 반응과 밀접한 관련이 있는 전사조절인자 NF-κB의 활성에 대한 영향을 조사하기위하여 transient transfection과 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 수행한결과, OVA 100 ㎍/㎖, gelatin 50 ㎍/㎖ 이상에서 NF-κB 전사인자의 활성도와 결합능이 OVA과 gelatin의 농도에 비례하여 증가하였다.
    ${\cdot}$OVA과 gelatin에 의한 COX-2의 발현에 관여하는 전사인자들을 확인하기 위하여 cloning 한 COX-2 promoter를 이용하여 transient transfection을 수행한 결과, NF-κB와 AP-1의 결합부위가 OVA과 gelatin에 의한 COX-2 발현에 중요한 역할을 함을 규명하였다.
    ${\cdot}$자가 면역증을 유발할 수 있어 면역반응의 중요한 지표로 사용되는 IgM과 IgE의 양을 OVA과 gelatin이 증가시킴을 확인하였으며, 임파구, NK (natural killer) 및 LAK (lymphokine-activated killer) cell 이 활성화됨을 조사하였다.
    ${\cdot}$In vitro 실험의 유의성과 효율성을 검증하는 한편, 동물실험을 통한 면역독성평가 방법을 개발하기 위하여, 실험동물에 기낭을 형성한 후, 형성된 기낭에 OVA과 gelatin을 50 ㎍/㎖이상 처리한 pouch fluid에서 농도에 의존적으로 $PGE_{2}$의 생성량 및 COX-2 유전자 발현이 증가하였으며, 삼출액 양, 단백질의 양 및 염증성 세포 수가 OVA와 gelatin의 농도 의존적으로 증가하였다. 위의 결과로 미루어 OVA 및 gelatin에 대한 in vitro와 in vivo 실험 모두에서 50 ㎍/㎖ 이상의 OVA와 gelatin은 염증성 cytokines과 NO, COX-2의 발현을 농도 의존적으로 증가시킴을 확인하였다.
    ${\cdot}$이상의 결과로부터, 바이오제품 중 백신제조 시 사용되는 첨가물질 및 함유물질의 생체 내 염증반응과 그 부작용 등 면역독성평가 방법을 분자적 수준에서 검색하기위한 macrophage 세포에서 $PGE_{2}$, NO, cytokines의 생산량의 측정을 활용한 1차 스크리닝 방법을 개발하였으며, COX-2 promoter reporter constructs를 이용한 COX-2의 활성의 측정으로 정량적인 COX-2 활성의 증가를 확인과, COX-2 promoter의 deletion constructs와 mutants constructs를 이용한 COX-2 발현 조절의 작용기전을 평가할 수 있는 면역독성평가 방법을 개발 하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 최종보고서...1
    2. 표지...3
    3. 제출문...6
    4. 요약문...7
    5. Project Summary...8
    6. 목차...9
    7. 제1장 서론...10
    8. 제2장 국내.외 기술개발 현황...14
    9. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...17
    10. 가. 연구내용.....
    1. 최종보고서...1
    2. 표지...3
    3. 제출문...6
    4. 요약문...7
    5. Project Summary...8
    6. 목차...9
    7. 제1장 서론...10
    8. 제2장 국내.외 기술개발 현황...14
    9. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과...17
    10. 가. 연구내용...17
    11. 나. 연구방법...19
    12. 다. 연구 결과...22
    13. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...68
    14. 가. 연구개발 목표의 달성도...68
    15. 나. 기대효과...68
    16. 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획...69
    17. 가. 계량적 성과...69
    18. 나. 성과내용기술...69
    19. 다. 활용계획...69
    20. 제6장 기타 중요변경사항...71
    21. 제7장 참고문헌...72
  • 참고문헌

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