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보고서 상세정보

염증성 사이토카인의 조절 시스템을 이용한 바이오제품의 면역독성 평가기술개발 연구
Development of immunotoxicity assesments of biomaterials using regulatory systems of inflammatory cytokines

  • 사업명

    식품의약품안전성관리

  • 과제명

    바이오제품의 독성평가기술개발

  • 주관연구기관

    조선대학교
    Chosun University

  • 연구책임자

    정혜광

  • 참여연구자

    김지영   신동원   이경진   오덕희   조영난   김형균  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2003-11

  • 과제시작년도

    2003

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016480

  • 과제고유번호

    1470001144

  • 키워드

    염증성 사이토카인.바이오제품.면역독성.inflammatory cytokines.iNOS.Cyclooxygenase-2.biomaterials.immunotoxicity.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immunotoxicity of biomaterials, espe...

    This study was focused on the development of molecular biological methods for evaluating the immunotoxicity of biomaterials, especially for the identification of the effects of biomaterials on the production of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2. This was accomplished using collagen and gelatin as a target molecules, those are thought as a useful macromolecules for artificial skin, joint, cartilage and cosmetics. It was up to 50 ug/ml of collagen or gelatin that was effective for the up-regulation of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2 in dose-dependent manner. By the result of the experiments to investigate the activity and the amount of COX-2, the production of PGE2 and the transcriptional level of COX-2 were increased in dose-dependent manner after the treatment of collagen or gelatin into Raw 264.7 cells but the transcriptional level of COX-1 was not. Additionally, the production of PGE2 in pouch fluid was increased in dose-dependent manner after the treatment of collagen or gelatin into the pouch region of mouse. The transactivity and DNA binding ability of NF-kB after the treatment of collagen or gelatin Were enhanced in dose-dependent manner by the results of transient transfection experiment and EMSA. From these results, the increment of NO production and transcriptional up-regulation of inflammatory cytokines, iNOS and COX-2 could be induced by the activation of NFkB in Raw 264.7 cells. The human COX-2 promoter regions were cloned into pGL3-basic vector containing luciferase reporter gene to investigate the DNA elements within COX-2 promoter region and the transcription factors involving in the transcriptional regulation of OX-2. The transcriptional regulation of COX-2 might be regulated by NFkB and AP-1 after the treatment of collagen or gelatin in Raw 264.7 cells by the results of transient transfection experiment using deletion constructs and site-directed mutation constructs of COX-2 promoter and EMSA. From these results, we could suggest that the analysis of PGE2 amount produced by biomolecules in macrophage cells is useful as a primary screening method for evaluation of immunotoxicity of biomaterials. Quantitative analysis for immunotoxicity of biomaterials could be possible from the assessment of luciferlase activity using COX-2 promoter reporter constructs. In addition, it is suggested that transcriptional regulation mechanism of COX-2 by biomaterials could be identified deletion constructs and site-directed mutation constructs of COX-2 promoter.


    본 연구에서는 현재 많이 활용되고, 그 응용 분야가 급속도로 증가하고 있는 바이오 제품의 면역독성의 평가 기술을 개발하여, 바이오 제품의 안전성을 분자적 수준에서 신속하게 검증 할 수 있는 면역독성 평가 방법을 개발하고자 하였다. ...

    본 연구에서는 현재 많이 활용되고, 그 응용 분야가 급속도로 증가하고 있는 바이오 제품의 면역독성의 평가 기술을 개발하여, 바이오 제품의 안전성을 분자적 수준에서 신속하게 검증 할 수 있는 면역독성 평가 방법을 개발하고자 하였다. 이에 모델 물질로 현재 조직공학적 인공피부 및 인공 관절로의 활용이 시도되고 있으며, 그 활용분야가 점점 증가하고 있는 천연고분자 물질인 collagen과 gelatin을 그 모델 물질로 선정하였다. 바이오 제품의 면역독성 평가를 위하여 평가 기준으로 면역의 가장 기본적인 위험신호의 하나인 염증을 평가 기준으로 선정하여, 염증과 직접적인 관련이 있는 염증성 cytokines과, iNOS (inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2 (cyclooxygenase-2)의 발현 및 조절을 지표로 바이오제품의 영향과 그 작용기전을 평가 할 수 있는 기술을 개발하였다. 모델 물질로 삼은 collagen과 gelatin을 이용하여, 면역독성에 대한 실험을 수행한 결과, Collagen 과 gelatin에 의한 염증관련 효소의 일종인 cyclooxygenase의 활성에 대한 영향을 Raw264.7 세포를 이용하여 $PGE_{2}$의 생성량을 측정 측정하였다. 그 결과 Collagen 과 gelatin 모두 50㎍/㎖ 이상의 농도를 처리 하였을 경우 배양액에 존재하는$PGE_{2}$의 양이 농도 의존적으로 증가하였다. 이러한 결과가 cyclooxygenase 유전자의 발현에 의한 것인지를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행한 결과 collagen과 gelatin의 농도에 의존적으로 COX-2가 증가하였으며, COX-1 유전자의 발현은 변화가 없었다. invitro 실험의 유의성과 효율성을 검증하는 한편, 동물실험을 통한 면역독성평가 방법을 개발하기 위하여, 실험동물에 기낭을 형성한 후, 형성된 기낭에 collagen 혹은 gelatin을 50㎍/㎖ 이상 처리한 pouch fluid에서 $PGE_{2}$의 생성량을 측정한 결과, collagen 과 gelatin의 농도에 의존적으로 PGE2의 양이 증가하였다. 면역독성의 다른 지표로 사용하였던 NO 및 염증성 cytokines과 iNOS에 대한 실험을 수행하였다. Collagen과 gelatin을 처리한 RAW 264.7세포에서 NO 생성의 증가와 iNOS, 염증성 cytokines 의 생성이 농도 의존적을 증가하는 것을 RT-PCR과 ELISA 방법을 통해 확인 할 수 있었다. 이러한 염증관련인자들의 반응과 밀접한 관련이 있는 전사조절인자인 NF-κB의 활성에 의한 것인지를 알아보기 위하여 transient transfection과 electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 수행하였다. 그 결과, collagen과 gelatin 50㎍/㎖ 이상에서 NF-κB 전사인자의 활성도와 결합능이 collagen과 gelatin의 농도에 비례하여 증가하였다. Collagen 과 gelatin에 의한 COX-2의 발현에 관여하는 전사인자들을 확인하기 위하여 COX-2 promoter를 cloning하였으며, 이를 이용하여 transient transfection 과 EMSA를 수행한 결과, NF-κB와 AP-1의 결합부위가 collagen 과 gelatin에 의한 COX-2 발현에 영향을 주는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로 모델 물질로 선정하였던 collagen과 gelatin에 대한 in vitro와 in vivo실험 모두에서 저 농도의 collagen 과 gelatin은 아무런 면역독성을 나타내지 않았으나, 50㎍/㎖이상의 농도에서는 염증성 cytokines과 NO, COX-2의 발현을 농도 의존적으로 증가시켰다. 또 한 이러한 일련의 염증반응들이 그 전사 조절인자의 활성에 의한 염증관련 유전자의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. 이들 결과로부터, 바이오제품의 생체내 염증 반응과 그 부작용 등 면역독성을 분자적 수준에서 검증하기 위하여, macrophage 세포에서 PGE2, NO, cytokines의 생산량을 알아보는 1차 스크리닝 방법을 독성평가 방법으로 개발하였으며, COX-2 promoter reporter constructs를 이용한 COX-2의 활성의 측정으로 정량적인 COX-2 활성의 증가를 확인 할 수 있는 방법과, COX-2 promoter의 deletion constructs와 mutants constructs를 이용하여 COX-2 발현조절의 작용기전을 평가할 수 있는 방법을 개발 하였다.


  • 목차(Contents) 

    1. 최종보고서...1
    2. 표지...3
    3. 제출문 ...6
    4. I. 연구사업 최종보고서 요약문 ...7
    5. 1. 국문요약문 ...7
    6. 2. SUMMARY ...8
    7. 목차 ...9
    8. 제1장 서론 ...10
    9. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...14
    10. 제3장...
    1. 최종보고서...1
    2. 표지...3
    3. 제출문 ...6
    4. I. 연구사업 최종보고서 요약문 ...7
    5. 1. 국문요약문 ...7
    6. 2. SUMMARY ...8
    7. 목차 ...9
    8. 제1장 서론 ...10
    9. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...14
    10. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...16
    11. 가. 연구방법...16
    12. 나. 연구내용 및 결과...19
    13. 다. 비상세포의 임파구 생산 cytokine 측정...37
    14. 라. lgM-측정...41
    15. 마. Raw 264.7세포의 배양과 in vivo 실험을 통한 pouch fluid의 Prostagland in E2 측정...43
    16. 바. COX-2 특이적인 Primer을 제작하여 RT-PCR 방법을 통한 COX-2 발현 측정...46
    17. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...59
    18. 가. 연구개발 목표의 달성도...59
    19. 나. 기대효과...59
    20. 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...60
    21. 가. 계량적 성과...60
    22. 나. 성과내용기술...60
    23. 다. 활용계획...61
    24. 제6장 기타 중요변경사항 ...62
    25. 제7장 참고문헌 ...62
  • 참고문헌

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