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보고서 상세정보

바이러스 백신의 국제표준시험물질의 기반구축을 위한 연구(III)
The study for constructing the international biological standard of viral vaccines (III)

  • 사업명

    식품의약품안전성관리

  • 과제명

    바이러스백신의 국제표준시험물질의 기반 구축을 위한 연구

  • 주관연구기관

    한국생명공학연구원
    Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

  • 연구책임자

    부하령

  • 참여연구자

    박지연   표현미   유경숙  

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2003-11

  • 과제시작년도

    2003

  • 주관부처

    식품의약품안전청

  • 사업 관리 기관

    식품의약품안전청
    Korea Food & Drug Administration

  • 등록번호

    TRKO201000016580

  • 과제고유번호

    1470000452

  • 키워드

    백신.표준품.파필로마바이러스.효모.바이러스 유사입자.세포매개면역.vaccine.standard.HPV.yeast.Virus-like particle.cell-mediated immunity.

  • DB 구축일자

    2013-04-18

  • 초록 


    In order to assure the quality of vaccine, the vaccine products should be consistently produced and controlled to the quality sta...

    In order to assure the quality of vaccine, the vaccine products should be consistently produced and controlled to the quality standards which was defined as Good Manufacturing Practice (GMP) by WHO. Human papilloma virus is one of the most common viral infections and a significant proportion of cancer is associated with HPV infection. But HPV cannot cultivate in cell culture so that HPV recombinant virus-like particles are considered as a promising vaccine and there are many researches and applications of vaccine studies in this field. To perform the prophylactic study of vaccine derived from human papillomavirus (HPV) using Balb/c mouse, we produced virus like particles consisted of HPV capsid protein L1 which was reported to induce significant humoral and cellular immunity using various animmal model systems. In order to produce HPV 16 VLPs, the cDNA of L1 capsid protein in HPV type 16 is inserted into yeast expression vector, pYEG-HIR525 under the control of GAL10 promoter. The transformation of pYEG-HPV16 L1 was performed into the yeast Saccharomyces cerevisiae Y2805 by lithium acetate method and the yeast clone of expressing highest level of L1 capsid protein of human papillomavirus type 16 was selected by Western blot analysis using anti-HPV16 L1 antibody. The purification of HPV16 VLP has been performed by ultracentrifugation and gel-filtration method. To validate the vaccine efficacy of the purified HPV16 VLPs to induce the humoral immunity, ELISA assay was performed and a significant increased production of anti-HPV16 VLP antibodies was observed in sera from immunized mice. The neutralization activity of antibodies in the sera from the vaccinated mice was demonstrated by a rapid and simple assay to detect hemmagglution inhibition activity. To ascertain cell-mediate immunity induced by HPV16 L1 VLPs, we checked lymphoproliferation and cytolytic T lymphocyte activation. C57BL/6 mouse were immunized with HPV16 L1 VLPs by subcutaneous injection and lymphocyte was prepared from spleen. Primed lymphocyte proliferates rapidly when it was restimulated with HPV16 L1 VLPs. Using this property, we checked the proliferation of T cells from immunized mouse by measuring the thymidine uptake of lymphocytes. Compared to the control, which was immunized with PBS, lymphocytes from HPV16L1 VLPs immunized group were augmented. Whether HPV16 L1 VLPs would induce the cytolytic T lymphocyte activation, we conducted chromium release assay for cytotoxic T cell activity using B16 stable transfectant expressing HPV16 L1 as target cells, which expression was checked by RT-PCR and western blot. T cells from C57BL/6 mouse immunized with HPV16 L1 VLPs showed significantly higher chromium release than controls, which were immunized with PBS. The lymphoproliferation activity of splenocytes from VLP immunized mice is about three times higher than that from control mice immunized with PBS after the stimulization of 0.3 ug/ml of VLP. The VLP immunized group of C57BL/6 mice displays more than 40% of specific lysis compared to 10% of that in PBS immunized control mice at the E/T ratio of 160.


    I. 연구개발의 목적 및 필요성
    세계적으로 생명공학을 기초로 개발한 생물학 제제를 생산하는 제조자들은 제품에 대해 국제적으로 공인된 안전성 및 효과 실험의 수행이 필수불가결 하다. 특히 질병의 조절을 가장 경제적이고 효과적으로...

    I. 연구개발의 목적 및 필요성
    세계적으로 생명공학을 기초로 개발한 생물학 제제를 생산하는 제조자들은 제품에 대해 국제적으로 공인된 안전성 및 효과 실험의 수행이 필수불가결 하다. 특히 질병의 조절을 가장 경제적이고 효과적으로 해결할 수 있는 생물의약품 중 하나인 백신은 매번 생물에서 생산된 물질을 제제로 이용하기 때문에 매번 batch마다 생산된 제품이 상이할 수 있다. 따라서 생산품의 안전성과 효과를 확인하기 위한 매우 엄격한 표준품의 설정 및 validation이 절실히 요구되고 있다.
    II. 연구개발의 내용 및 범위
    1999년 제네바에서 열린 WHO 회의에서 HPV 감염을 억제하기 위한 예방백신 개발의 최근동향에 대한 협의 결과에 의하면 HPV 백신의 임상실험 표준물질을 적극 권장하고 있다. 따라서 생물의약품인 바이러스백신의 국제표준시험물질의 기반구축을 위하여 조만간 개발되고 출시될 예정인 인간 파필로마바이러스 백신의 후보물질인 바이러스유사입자를 모델 시스템으로 이용하기 위하여 파필로마바이러스유사입자를 실제로 발현, 정제하여 이 물질을 이용한 면역유도효능을 측정하여 바이러스백신의 validation 및 백신으로서의 실질적인 표준실험물질 설정을 위한 기반연구를 수행하고자 한다.
    III. 연구개발결과
    바이러스백신의 validation 및 백신으로서의 실질적인 표준실험물질 설정을 위한 기반연구를 수행하고자 조만간 개발되고 출시될 예정인 인간 파필로마바이러스 백신의 후보물질인 바이러스유사입자를 모델 시스템으로 이용하기 위하여 HPV 백신 제제인 HPV16 L1표면 단백질로 이루어진 파필로마바이러스 유사입자를 Yeast 균주에서 재조합단백질로 발현시켜서 HPV16 바이러스유사입자를 생산하였다. 그리고 백신 후보물질의 활용성을 검증하기 위하여 항체생성능실험을 수행한 결과 현저한 파필로마바이러스 특이 항체 생성능과 바이러스 감염을 억제하는 중화활성을 확인하였다. 또한 HPV 바이러스 유사입자의 세포면역 유도활성을 검색하기 위하여 유사입자를 주사한 마우스의 림프구증식활성 검색을 수행하였고 HPV16 L1을 발현하는 마우스 유래의 세포주를 구축하여 cytotoxic T lymphocytes의 세포면역활성 검색을 수행하였다.
    IV. 연구개발결과의 활용결과 및 계획
    파필로마바이러스 type 16 주요 capsid L1단백질을 yeast system에서 발현, 정제시킨 유사입자를 이용하여 in vitro 및 동물 모델을 이용한 면역유도능을 실험 확인함으로써 생물의약품 국제표준실험물질 생산 및 기반구축 연구를 수행하고 국내 파필로마바이러스 백신연구의 발전에 기여할 것으로 사료된다.


  • 목차(Contents) 

    1. 최종보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 요약문 ...5
    5. Project Summary ...6
    6. 목차 ...7
    7. 제1장 서론 ...8
    8. 가. 생물의약품 표준품설정의 중요성 ...8
    9. 나. 파필로마바이러스백신의 모델시스템으로써의 중요성 .....
    1. 최종보고서 ...1
    2. 표지 ...2
    3. 제출문 ...4
    4. 요약문 ...5
    5. Project Summary ...6
    6. 목차 ...7
    7. 제1장 서론 ...8
    8. 가. 생물의약품 표준품설정의 중요성 ...8
    9. 나. 파필로마바이러스백신의 모델시스템으로써의 중요성 ...8
    10. 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...11
    11. 가. 국외 기술현황 ...11
    12. 나. 국내 기술현황 ...11
    13. 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...13
    14. 1. HPV L1 유전자의 클로닝 ...24
    15. 2. 재조합 HPV L1을 발현하는 Saccharomyces cerevisae Y2805 균주 스크리닝 및 HPV L1 발현 확인 ...26
    16. 3. 대량 배양 ...27
    17. 4. 세포 파쇄액 준비 ...27
    18. 5. 정제 ( purification ) ...28
    19. 6. 전자현미경 관찰 ...29
    20. 7. 마우스를 이용한 HPV16 L1의 항체면역 유도능 검색 ...29
    21. 8. HPV16 L1를 주사한 마우스에서 채취한 항체의 중화활성 검색 ...30
    22. 9. HPV16 L1를 주사한 마우스에서 채취한 splenocytes의 세포매개면역 검색 ...30
    23. 10. HPV1 6L1 gene의 codon modification ...32
    24. 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...35
    25. 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...36
    26. 가. 계량적 성과 ...36
    27. 나. 성과내용기술...36
    28. 다. 활용계획 ...36
    29. 제6장 기타 중요변경사항 ...36
    30. 제7장 참고문헌 ...37
    31. 총괄 연구과제 요약...39
  • 참고문헌

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