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보고서 상세정보

역분화 및 성체 줄기세포를 이용한 독성평가용 세포 모델 개발 및 활용 연구

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    역분화 및 성체 줄기세포를 이용한 독성평가용 세포 모델 개발 및 활용 연구

  • 주관연구기관

    농림축산검역본부
    Animal and Plant Quarantine Agency

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-12

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000695

  • 과제고유번호

    1545008939

  • 키워드

    성체줄기세포.역분화 세포.대사성질병.세포모델 유용물질.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • 초록 


    ...


    5. 최종 연구결과 요약

    제1세부과제명: 역분화 줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발
    1. 마우스 체세포 (fibroblast)을 이용한 역분화줄기세포 확립 (1차년도)
    1) 마우스...

    5. 최종 연구결과 요약

    제1세부과제명: 역분화 줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발
    1. 마우스 체세포 (fibroblast)을 이용한 역분화줄기세포 확립 (1차년도)
    1) 마우스 역분화줄기세포 확립
    (1) 렌티바이러스 (lentivirus)를 이용한 체세포의 역분화 유도
    ① 역분화 인자 (OCT4, SOX2, KLF4, c-Myc)를 포함한 독시사이클린 유도 렌티바이러스(doxycycline-inducible lentiviral vector)를 이용하여 마우스 섬유아세포 (MEF)로 도입
    ② 완전 역분화줄기세포 3종 (#15, #60, #91) 및 부분 역분화줄기세포 2종 (#89-7D, #102-2D) 확보
    (2) 역분화줄기세포 특성분석
    ① 역분화줄기세포 3종에 대한 특성분석
    ∘ 다능성 표지인자의 염색 (immunocytochemistry); AP, SSEA-1, Nanog, Oct3/4 항체에 양성적인 반응을 보임
    ∘ 유전자 발현검증 (qRT-PCR); nanog, stella, rex1, oct3/4, sox2, klf4, c-Myc의 유전자 발현확인
    ∘ 메틸화 (methylation) 분석; nanog와 oct3/4 프로모터 CpG site의 메틸화가 ES와 유사함
    ∘ 체외 분화유도 (embryoid body formation); embryoid body 형성을 이용하여 외배엽, 중배엽 및 내배엽분화됨을 Nestin, SM22-alpha, Sox17, Albumin 지표로 확인
    ∘ 기형종 (teratoma) 형성; 모든 세포주가 면역결핍마우스의 피하부위에 기형종 형성 및 삼배엽분화 확인
    (3) 소분자 화합물을 이용한 부분 역분화줄기세포의 완전 역분화줄기세포 유도
    ① 부분 역분화줄기세포주 2종 (#89-7D, #102-2D)은 독시사이클린 노출하에서 배양 유지됨
    ② 독시사이클린 제거시 대부분의 세포가 분화되며, 일부 우발적 발생에 의한 집락이형성
    ③ 히스톤 탈아세틸효소 억제자 (valproic acid, trichostatin A, sodium buytrate)와 DNA 탈메틸전달효소 억제자 (5-Aza)를 이용하여 역분화 효율증진, 특히 1mM sodium butyrate이 가장 효율적으로 역분화를 유도함
    2. 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 이용한 역분화줄기세포 확립 (2·3차년도)
    1) 인간 지방조직으로부터 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 분리 및 확보
    (1) 지방조직유래 중간엽줄기세포의 분리 및 특성분석
    ① 삼성서울병원으로부터 IMR 승인 후 환자의 지방조직을 공급받아 연구 수행함 (6회)
    ② 지방조직으로부터 CD105 항체를 이용한 MACS를 진행하여 CD105(+)와 CD105(-) 세포주 분리 및 확보
    ③ MACS 분리된 지방조직 세포들의 특성
    ∘ CD 마커 (CD13, CD34, CD44, CD45, CD105, CD166)염색을 통한 FACS 분석
    ∘ 중간엽줄기세포 (CD105+)는 세포형태와 면역학적 표현형을 검증, 비중간엽줄기세포는 MACS 음성세포 (CD105-)를 사용함
    (2) 중간엽줄기세포를 이용한 역분화줄기세포 유도
    ① 레트로바이러스 생산 및 감염
    ∘ 293FT세포에 레트로바이러스 벡터를 FuGene6을 이용하여 바이러스 용액 생산
    ∘ pMXs-GFP 레트로바이러스를 이용한 세포감염성 확인; 시간별 GFP 발현 양 및 발현 세포수; NIH3T3 > CD105(-) > CD105(+)
    ② 역분화줄기세포를 유도
    ∘ OCT4, SOX2, KLF4, C-MYC 레트로바이러스 (1:1:1:1)를 각각 생산하여 4차 분리된 CD105(+)와 CD105(-) 세포에 도입함
    ∘ CD105(+)와 CD105(-)의 레트로바이러스에 의한 역분화 효율비교
    - TRA-1-60 항체에 의한 역분화 효율; CD105(+) < CD105(-) (0.009 vs. 0.016%)
    - AP 염색에 의한 역분화 효율; CD105(+) < CD105(-) (0.025 vs 0.048%)
    ∘ 역분화 효율의 차이는 세포간 레트로바이러스에 대한 감염력의 차이
    ③ 역분화줄기세포 검증 및 확립
    ∘ 중간엽줄기세포와 비중간엽줄기세포 유래의 역분화 줄기세포 각 1종 확립
    - 중간엽줄기세포; QIA11, 비중간엽줄기세포; QIA7
    ∘ 다능성 표지인자의 염색 (immunocytochemistry); AP, NANOG, OCT4, SSEA-3, SSEA-4 그리고 TRA1-60 항체에 양성적인 반응을 보임
    ∘ 유전자 발현검증 (qRT-PCR); NANOG, OCT4, GDF3, REX1, hTERT, SOX2, KLF4, c-MYC의 유전자 발현 확인
    ∘ 메틸화 (methylation) 분석; NANOG와 OCT4 프로모터 CpG site의 메틸화가 대조군과 비교하여 탈메틸화됨
    ∘ 체외 분화유도 (embryoid body formation); embryoid body 형성을 이용하여 외배엽, 중배엽 및 내배엽분화 확인
    3. 인간 역분화줄기세포의 간장세포 분화 (3·4차년도)
    1) 인간 역분화 줄기세포의 간장세포 분화기법 확립
    (1) 간장세포 분화유도 및 분화단계별 성상확인
    ① 진정내배엽분화 (Stage I), 간장세포유도 (Stage II), 간장세포성숙 (Stage III) 3단계 분화유도
    ② 각 분화단계별 표지 유전자 및 단백질의 발현양상 확인
    ∘ 배아줄기세포 특이 유전자; NANOG, OCT4
    ∘ 진정 내배엽세포 특이 유전자; CXCR4, SOX17, FOXA2, GATA4
    ∘ 간장세포 특이 유전자; ALB, AFP, HNF4a, C/EBPa, CYP3A4
    ③ 분화유도된 간장세포의 형태, 글라이코겐 합성 (PAS염색), ALB 및 AFP 발현을 확인
    (2) 미분화 줄기세포유래 비간장세포 증식
    ① Activin A에 의한 진정 내배엽분화 유도 후 NANOG, OCT4, TRA-1-60 항체 및 유전자에 양성반응을 보이는 미분화 줄기세포 존재
    ② 내배엽분화단계에 존재하는 미분화 줄기세포는 형태적으로 비간장세포로 분화하며 최종적으로 분화단계 Stage III에서 간장세포의 순도 (purity) 를 낮춤
    ③ 3배엽 유전자 발현 분석결과 미분화줄기세포 유래 세포는 AFP와 IGF2 유전자의 발현이 증가함
    2) 미분화줄기세포 제거를 통한 간장세포 분화효율 향상
    (1) Survivin억제자인 YM155처리를 통한 미분화 줄기세포 제거
    ① 배아줄기세포 (WA01)와 역분화줄기세포 (QIA7)를 이용한 YM155의 농도별 MTT진행
    ② 역분화줄기세포의 간장세포 분화단계 Stage II에서 YM155 (DMSO, 1, 5, 10, 50nM)에 대한 결과
    ∘ 농도 의존적으로 미분화줄기세포 마커 유전자인 NANOG, OCT4 발현이 현저히 감소함
    ∘ 진정 내배엽 마커 유전자인 CXCR4, SOX17, FOXA2 발현이 농도 의존적으로 증가함
    ∘ 미분화 줄기세포 마커 항체인 OCT4와 TRA-1-60 양성세포가 농도 의존적으로 감소함
    ③ Stage III에서 YM155 (DMSO, 1, 5, 10, 50nM)처리에 따른 효율검증
    ∘ 5nM 이상 YM155농도에서 형태적으로 미분화줄기세포유래 비간장세포가 현저히 제거됨
    ∘ ALB 양성반응 세포수가 비처리군에 비해 5nM에서 약 2배 증가함 (41.9% vs. 74.8%)
    ∘ CYP1A2 및 3A4의 활성도가 5nM과 10nM에서 통계적 유의한 증가를 보임
    ∘ 5nM YM155에서 유전자발현을 확인한 결과 간장세포 특이 유전자 (ALB, AFP, HNF4a)의 발현이 모든 농도에서 대조군에 비해 증가하였으며, 외배엽 (PAX6, NESTIN, NCAM) 및 중배엽 (MSX1, TNNT2) 특이 유전자들의 발현은 현저히 낮아짐
    ∘ 미분화 표지 유전자인 NANOG와 OCT4의 발현이 YM155(5nM) 처리 후 급격하게 감소하였고 분화완료시점인 15일에서 완전히 감소함
    (2) 배아줄기세포 (WA01)의 간장세포 분화에서의 YM155의 적용
    ① 간장세포 분화 및 YM155처리 효과
    ∘ 역분화줄기세포에서 확립된 분화법하에서 분화시킨 결과 간장세포 형태 및 간장세포 지표들에 대한 양성반응을 확인 (글라이코겐 합성, ALB, CYP1A1, 1A2, 3A4 발현)
    ② ALB 분비에서 5nM YM155 처리군에서 대조군에 비해 유의하게 증가함
    ③ Urea 분비에서는 유의적인 증가는 관찰되지 않음
    4. 인간 역분화줄기세포의 간장독성평가 활용 (4차년도)
    1) 아세트아미노펜 (AAP)과 아플라톡신 B1 (AFB1)의 간장발달독성 평가
    (1) 인간 배아 및 역분화줄기세포의 간장세포 발달
    ① 배아(WA01) 및 역분화줄기세포주(QIA7)를 진정내배엽분화(Stage I), 간장내배엽(Stage II), 간장세포 미성숙단계(Stage III) 그리고 성숙 간장세포(Stage IV) 4단계 분화유도
    ∘ Stage III는 간장전구세포가 간장세포로 발달하는 단계 (hepatic specification)
    ∘ 이 기간 동안 약물 처리를 통한 간장발달을 확인
    ② Stage III 단계의 특성
    ∘ WA01-iHeps와 QIA7-iHeps에서 14종 간장세포 특이 유전자 발현됨. 하지만 인체 간장세포 (p-Heps)에 비교해 낮은 수준임
    ∘ 이 기간 동안 albumin 분비가 시작하지만 urea 분비는 일어나지 않음
    (2) AAP 및 AFB1의 간장발달독성 평가
    ① Stage III 전 단계 (7일) 동안 AAP 및 AFB1 처리에 대한 세포독성 평가
    ∘ 약물 농도별 세포 생존율 (WST assay)
    - WA01-iHeps와 QIA7-iHeps에서 AAP에 의한 농도감수성이 유사함
    - AFB1에 대해서는 WA01-iHeps이 QIA7-iHeps에 비교하여 농도감수성이 낮음
    ∘ 세포다기능 측정 (High content screening)
    - 핵 (Hohest), 마이토콘드리아 (TMRM), 칼슘 (Fluo-4AM), 항산화적 스트레스 (BODIPY)의 변화를 확인
    ② AAP 및 AFB1 처리에 대한 간장기능에 미치는 효과 평가
    ∘ 간장세포 특이 유전자 발현 (RT-PCR)
    - AAP에서 ALB와 CYP3A4를 제외한 모든 유전자가 저농도 (0.78 - 3.1mM)에서 증가하지만 고농도(6.3mM)에서는 감소함. 하지만 WA01-iHeps와 QIA7-iHeps간 농도별 발현 차이 관찰
    - AFB1에 대해서는 비독성 농도인 3.1uM부터 AAT, AFP, ALB, GSTA1, HNF4A, TAT 그리고 TTR의 유전자 발현이 급격하게 낮아짐. 하지만 C/EBPA, GSTP1 그리고 TDO의 발현변화는 농도 의존적이지 않음
    ∘ Albumin/urea 분비능
    - WA01-iHeps와 QIA7-iHeps에서 AAP와 AFB1 농도 의존적으로 albumin과 urea분비능이 감소함 하지만 urea 분비능은 변화 없음 (이 단계에서는 urea분비 되지 않음)
    2) 아세트아미노펜 (AAP)과 아플라톡신 B1 (AFB1)의 간장독성 평가
    (1) 분화 완료된 간장세포 (Stage IV)를 이용한 독성평가
    ① Stage IV (분화 21일째)의 간장세포를 이용하여 AAP와 AFB1 (48h)에 대한 세포독성
    ∘ 약물 농도별 세포 생존율 (WST assay)
    - AAP에 대해서는 12.5mM 이하의 농도에서는 감수성이 유사하나, 25mM부터 QIA7-iHeps가 WA01-iHeps에 비교하여 농도감수성이 낮음
    - WA01-iHeps와 QIA7-iHeps에서 AFB1에 의한 농도감수성이 유사함
    ∘ 세포다기능 측정 (High content screening)
    - 핵 (Hochest), 마이토콘드리아 (TMRM), 칼슘 (Fluo-4AM), 항산화적 스트레스 (BODIPY)의 변화를 확인
    ∘ Enzyme activity (ALT/LDH activity) 분석 중
    ② AAP와 AFB1에 대한 간장기능에 미치는 효과
    ∘ 약물에 대한 간장세포 특이 유전자의 발현의 영향 확인
    ∘ ALB/urea 분비능 및 CYP 활성도 측정 중

    제2세부과제명: 성체줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발
    1. 지방유래 성체줄기세포 획득을 위한 시료채취
    1) 삼성의료원과 협조체제 구축
    ∘ IRB 심사 및 승인, 지방조직 5회 수급
    2) 지방유래 성체줄기세포 획득 및 검증
    (1) MACS를 이용한 지방조직 내 성체줄기세포인 중간엽줄기세포 분리
    ① 지방조직세포를 CD105항체를 이용하여 MACS 분리함
    ② 환자 5명의 지방조직으로부터 CD105 양성 세포를 분리
    ③ CD105 양성 세포에 대한 특성을 면역염색
    ∘ 중간엽줄기세포 특이 항체인 CD13, CD34, CD44, CD105, CD166에 대한 양성반응 확인
    (2) 지방유래 중간엽줄기세포의 배양
    ① 계대 배양시 지방유래 줄기세포는 10계대까지 형태학적 변화가 없었으며, 7계대까지 줄기세포 분화인자(Oct4, Rex1, Sox2 및 Nanog) 발현 확인
    3) 간장세포로 분화조건 확립
    (1) 분화기간, 배지조성에 따른 두 가지 방법으로 간세포 분화 유도 및 비교
    ① 형태학적 관찰결과, 간장세포와 유사한 형태로 변화함
    ② 간세포특이단백질 항원표시인자 (AFP, CK18, GATA4) 발현됨
    ③ 약물대사효소인 CYP1A2, CYP3A4 활성이 증가됨
    ④ 분화세포 PAS 염색결과, 글리코겐 축적됨
    ⑤ 간장세포 특이 유전자 발현 증가됨
    2. 간세포분화 유도된 성체줄기세포를 이용한 간장독성 평가
    1) 비소의 간장세포 독성 평가
    ① 성상변화 확인
    ② 간장세포 특이 단백질 변화 확인 (ALB, AFP, GATA4, CK18)
    ③ 간장세포 특이 유전자 발현 변화 확인 (ALB, AFP, C/EBPA, CK18, HNF4A, CYP3A4, CYP1A2)
    ④ 세포 생존율 확인
    ⑤ Enzyme activity 확인 (ALT, LDH, AST)
    2) 아세트아미노펜의 간장세포 독성평가
    ① 성상변화 확인
    ② 간장세포 특이 단백질 변화 확인 (ALB, AFP, GATA4, CK18)
    ③ 간장세포 특이 유전자 발현 변화 확인 (ALB, AFP, C/EBPA, CK18, HNF4A, CYP3A4, CYP1A2)
    ④ 세포 생존율 확인
    ⑤ Enzyme activity 확인 (ALT, LDH, AST)


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 8
    4. 1. 연구배경 ... 8
    5. 2. 연구최종목표 ... 9
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 10
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 10
    8. 1...
    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 8
    4. 1. 연구배경 ... 8
    5. 2. 연구최종목표 ... 9
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 10
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 10
    8. 1. 재 료 ... 10
    9. Ⅲ. 연구결과 ... 11
    10. 가. 제1세부과제명: 역분화줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발 ... 11
    11. 나. 제2세부과제명: 성체줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발 ... 32
    12. IV. 연구결과요약 ... 37
    13. 1. 제1세부과제명: 역분화줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발 ... 37
    14. 2. 제2세부과제명: 성체줄기세포를 이용한 동물용의약품 등의 독성평가 및 세포모델 개발 ... 38
    15. V. 고 찰 ... 38
    16. VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 39
    17. Ⅶ. 참고자료 ... 41
    18. 끝페이지 ... 41
  • 참고문헌

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