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보고서 상세정보

화학물질의 저용량노출에 의한 발달신경독성검색용 세포 모델 개발 및 평가
Establishment of a stem cell based developmental neurotoxicity screening model to chronic low dose exposure of chemical

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    화학물질의 저용량노출에 의한 발달신경독성검색용 세포 모델 개발 및 평가

  • 주관연구기관

    농림축산검역본부
    Animal and Plant Quarantine Agency

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-12

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000696

  • 과제고유번호

    1545008881

  • 키워드

    발달신경독성.저용량 노출.줄기세포.세포모델.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • DOI

    https://doi.org/10.23000/TRKO201600000696

  • 초록 


    ...


    5. 최종 연구결과 요약

    [제1세부과제] 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립

    가. 마우스 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
    1) 신경분화 유도 최적조건 확립
    - 세개의 서로...

    5. 최종 연구결과 요약

    [제1세부과제] 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립

    가. 마우스 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
    1) 신경분화 유도 최적조건 확립
    - 세개의 서로 다른 분화법 (NS법, SP법, SC법)을 이용하여 신경세포로의 분화능을 비교결과 저용량 발달신경독성평가에 가장 적합한 분화법으로 NS법 결정
    2) 신경분화 단계 및 신경세포별 특이 발현 유전자 선발
    - 선택 된 NS법으로 분화를 진행시켜 분화 시작 후 0, 5, 10일째에 gene chip 분석
    - 분화 10일째에 발현이 2배이상 증가한 gene 중 GO분류상 “neurogenesis" 관련 유전자 선택, K-means clustering 실시
    - Cluster1: 신경세포의 분화, 발생과 관련한 유전자 그룹에 각각 43%와 33%의 유전자들이 속함
    - Cluster2: 신경세포의 분화, 발생, 신경돌기발달과 관련된 유전자 그룹이 확인되었으며 GO 분류상 신경세포분화와 관련한 그룹 중에는 희소돌기아교세포의 전사와 관련한 인자들이 포함됨
    - Cluster4: 신경의 분화 및 발생과 관련한 유전자그룹에 각각 47%, 33%의 유전자가 속해있으며 이 외에도 세포성분의 형태발생에 관여하는 유전자 그룹들이 다수 포함
    3) 신경분화 단계 및 신경세포별 특이 발현 유전자 및 단백질 발현도 조사
    - NS법으로 분화 시 신경계의 분화 양상과 비슷하게 marker 들이 변화함
    - 분화 10일째에 현저한 neuron, astrocyte, oligodendrocyte 마커단백들이 발현함
    나. 인체 줄기세포를 이용한 발달신경독성 모델 확립
    1) 인체역분화줄기세포(hiPS)를 이용한 신경줄기세포 분화법 확립
    - 인체 역분화 줄기세포 Kor-WT-iPSC3를 6일간 배상체로 유도→N2배지에서 2일간 부착 및 신경외배엽 분화유도→신경유도배지에서 2일간 배양 후 떠오르는 sphere 모음→accutase로 세포 분리하여 신경증식배지에서 배양→7일간 증식 후 accutase 이용 계대→신경전구세포 (NPC) 특성 확인
    - 총 17일간 분화로 NPC 세포괴 유도: 신경전구세포마커 (SOX1, SOX2, nestin, pax6) 및 신경세포마커(Tuj1) 발현 확인
    - 약 7일 간격으로 지속적 계대 가능함을 확인하였음
    2) 신경분화세포별 특이 발현 유전자 및 단백질 검색
    - 신경전구세포 특이 발현 유전자: PAX6, PLZF 발현증가
    - 신경세포 특이 발현 유전자: TUJ1 발현증가
    - 신경전구세포 특이 발현 단백: SOX1, SOX2, NESTIN, PAX6 발현
    - 신경세포 특이 발현 단백: TUJ1 발현

    [제2세부과제] 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가

    1) 저용량 발달신경독성 평가를 위한 시험물질 선정
    - 메틸 수은: 대표적 발달신경독성 물질
    - Ciprofloxacin (CPX) 과 bibphenyl acetic acid (BPAA) 병용투여: Fluoroquinolon과 NSAID 약물로서 병용투여 시 GABA 억제 상승작용이 알려져 있음
    2) 시험관 내 저용량 발달신경독성 평가법 확립
    - 세포주: 역분화줄기세포 (H9) 유래 신경줄기세포를 분화배지 (N2B27)에서 신경세포로 20일간 분화유도
    - 저용량 발달독성평가를 위한 화학물질 농도: 메틸수은 100~400 nM, CPX 25~100 μM, BPAA 50~200 μM
    3) 만성 저용량 노출이 신경분화단계별 특이 유전자 및 단백질에 미치는 영향 평가
    - 신경전구세포 특이 발현 유전자 (NESTIN, PROMININ) : 저용량 (100-200 nM)에서 증가, 400nM에서 감소
    - 신경세포 특이 발현 유전자인 TUJ1, GAD67 발현 저용량 (100-200 nM)에서 증가, 400nM에서 감소
    - 신경세포 특이 마커 단백: TUJ1 발현이 유의하게 증가함
    4) 만성 저용량 노출이 신경세포 기능에 미치는 영향 평가
    - High-content screening (HCS) 결과 미토콘드리아 막활성 변화, 산화스트레스로 인한 과산화지방질 축적, 세포질 내 칼슘이온 농도 등 변화 나타남
    - Membrane Potential Assay로 막전위변화를 확인한 결과 200-400 nM에서 막전위 감소양상 확인됨
    - Neurite outgrowth 측정 결과, neurite length, neurite max length with branches, neurite intensity, branch point, cross point 등이 MeHg 용량 증가 (100-400 nM)에 따라 감소하는 경향 나타남
    5) 만성 저용량 노출이 후성유전학적 변화에 미치는 영향
    - BDNF promotorⅣ의 일부 CpG site에서 methylation이 증가하는 경향이 나타남


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 수의과학기술개발연구사업 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
    8. 1. ...
    1. 표지 ... 1
    2. 수의과학기술개발연구사업 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 6
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
    8. 1. 재 료 ... 7
    9. 2. 연구전략 및 방법 ... 7
    10. Ⅲ. 연구결과 ... 8
    11. 제1세부과제 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립 ... 8
    12. 제2세부과제 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가 ... 38
    13. Ⅳ. 연구결과요약 ... 45
    14. 제1세부과제 줄기세포를 이용한 발달신경독성 평가 모델 확립 ... 45
    15. 제2세부과제 줄기세포를 이용한 화학물질의 만성 저용량 노출에 의한 발달신경독성 평가 ... 46
    16. Ⅴ. 고 찰 ... 47
    17. Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 47
    18. 끝페이지 ... 48
  • 참고문헌

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