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보고서 상세정보

유방염 백신개발을 위한 황색포도상구균의 주요 병원성 인자 선발 및 유전자 재조합 단백질 합성
Selection and genetic recombination of critical virulence factors of Staphylococcus aureus for development of bovine mastitis vaccine

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    유방염 백신개발을 위한 황색포도상구균의 주요 병원성 인자 선발 및 유전자 재조합 단백질 합성

  • 주관연구기관

    농림축산검역본부
    Animal and Plant Quarantine Agency

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-12

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000706

  • 과제고유번호

    1545008894

  • 키워드

    황색포도상구균 백신.장독소.세포독소.Staphylococcus aureus.bovine mastitis.cytotoxins.staphylococcal enterotoxins.vaccine.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • DOI

    https://doi.org/10.23000/TRKO201600000706

  • 초록 


    Staphylococcus aureus is a major agent of bovine mastitis. Staphylococcal mastitis is highly contagious. The prognosis is variabl...

    Staphylococcus aureus is a major agent of bovine mastitis. Staphylococcal mastitis is highly contagious. The prognosis is variable, comparatively poor, and illness tends to become chronic and recurrent. Antibiotic therapy is often refractory due to the multidrug resistance. Several vaccines have been developed but showed limited successes due to the significant variations in virulence factors among the different strains of S. aureus isolated from mastitis, not enough understanding of bovine mastitis pathogenesis, and unique immune system in mammary gland. In this project, we analyzed the characteristics of S. aureus isolated from Korean farms to select Korean challenge strain for mastitis study. We generated a knock out strain lacking the most common virulence factors observed in Korean isolates and demonstrated that cytotoxins and staphylococcal enterotoxins are the most important virulence factors in bovine mastitis. For the vaccine application, staphylococcal enterotoxins lacking superantigenicity were generated using a site-directed mutagenesis. C57BL/6J mice were immunized with recombinant cytotoxins (HlgA, HlgC, LukE, LukS), modified enterotoxins (SEG, SEI, SEM, SEN, SEO), or a combination of cytotoxins and enterotoxins, and challenged with Korean challenge strain. Animals vaccination with a combination of cytotoxins and enterotoxins were fully protected, while others were not. These results suggest that cytotoxins and enterotoxins might be important vaccine candidates based on the conservation in clinical isolates, the role in bovine mastitis pathogenesis, and the protection in S. aureus infection.


    5. 최종 연구결과 요약

    1. 한국형 유방염 포도상구균 표준 균체선발
    ○ 한국내 농장에서 분리된 207주의 준임상형 포도상분리주에 대한 병원성인자 유전학적 분석결과,장독소 (SEA,SEK,SEQ,SEG,SEI,S...

    5. 최종 연구결과 요약

    1. 한국형 유방염 포도상구균 표준 균체선발
    ○ 한국내 농장에서 분리된 207주의 준임상형 포도상분리주에 대한 병원성인자 유전학적 분석결과,장독소 (SEA,SEK,SEQ,SEG,SEI,SEM,SEN,SEO),세포독소(Hla,Hlb,Hld,HlgA,HlgB,HlgC, LukD,LukE), 세포부착인자(clfA,clfB,ebh,emp,fbpA)가 가장 빈번히 관찰됨
    ○ 이들 병원성인자를 가지고 있는 K30분리주를 한국형 유방염 포도상구균 표준 균체로 선발하여 실험동물 및 목적동물 공격균주로 사용
    ○ 문헌정보및 미시시피주립대학교 예비결과를 토대로 장독소 8종(SEA,SEK,SEQ,SEG,SEI, SEM,SEN,SEO),세포 독소 7(HlgA,HlgB,HlgC,LukD,LukE,LukF, LukS)을 백신후보군으로 선정
    2. 선발된 백신후보군의 백신유효성 검증
    ○ 선발된 백신후보군의 유방염내 병원성 역할을 검증하기위하여 한국형 유방염 표준균제에 장독소및 세포독소를 제거한 약독화 균주를 제작
    ○ 제작된 약독화 균주의 유방내 감염을 통한 병원성 약독화를 확인함
    ○ 장독소 8종, 세포독소 7종을 백신후보군으로 선발
    3. 선발된 주요 유방염 병원성 인자에 대한 유전자 재조합 단백질 합성 및 백신 제작
    ○ 선발된 장독소 및 세포독소 백신후보군의 유전자 재조합 단백질 제작
    - 장독소에 공통으로 존재하는 MHC II와 high affinity로 결합하는 아미노산의 유전자 염기서열을 치환
    ○ 제작된 유전자재조합 단백질의 안전성 검사
    - T림프구 분열능실험 : Bovine T림프구분열능이 현저히 저하됨 확인
    - Cytokine, chemokine 발현능 비교: 비병원성 장독소에 의한 cytokine, chemokine발현능 저하 확인
    - 마우스 복강내 접종시 치사율을 보이지 않음
    ○ 제작된 유전자재조합 단백질 혼합백신의 유효성 검사
    - 마우스에서 장독소, 세포독소, 장독소및 세포독소 혼합백신을 근육주사로 2회 접종
    - 장독소 접종군 : 급성폐사는 관찰되지 않았으나 점진적 폐사율 발생 (40% 생존율)
    - 세포독소 접종군 : 급성폐사(50% 폐사율) 관찰
    - 장독소+세포독소 접종군 : 100%생존
    - 대조군 : 100% 폐사(12시간내)
    ○ 단일 그룹 병원성인자의 중화로는 효과적인 백신효과를 기대하기 어려우며 장독소 및 세포 독소 병원성인자의 복합 혼합이 필요한 것으로 사료됨
    ○ 현재 각 백신후보 단백질에 대한 특이항체가 및 중화반응을 검증하고 있으며 이를 통해 세부적인 백신후보군 단백질을 선발할 수 있을 것으로 사료됨


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
    4. 1. 연구배경 ... 4
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
    8. 1. ...
    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
    4. 1. 연구배경 ... 4
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 7
    8. 1. 연구재료 ... 7
    9. 2. 연구전략 및 방법 ... 8
    10. Ⅲ. 연구결과 및 고찰 ... 10
    11. 1. 황색포도상구균의 분리 및 동정 ... 10
    12. 2. 유방염 분리균주의 병원성 인자 발현 분석 ... 10
    13. 3. 황색포도상구균 분리주의 주요 병원성인자 분석을 위한 multiplex PCR확립 ... 10
    14. 4. 황색포도상구균 분리주의 주요 병원성인자 분석 ... 13
    15. 5. 유전자 재조합 Cytotoxin 제작 ... 18
    16. 6. 유전자 재조합 비병원성 장독소 제작 ... 18
    17. 7. 한국형 유방염 표준균체 선발 ... 19
    18. 8. 한국형 유방염 표준균주의 Knock-out 약독화 균주 제작 및 병원성 확인 시험 ... 20
    19. 9. 선발된 장독소 및 세포독소 백신후보군의 유전자 재조합 단백질 제작 ... 21
    20. 10. 제작된 비병원성 장독소 안전성 검사 ... 23
    21. 11. 제작된 유전자재조합 단백질 혼합백신의 유효성 검사 ... 25
    22. Ⅳ. 연구결과요약 ... 29
    23. 1.황색포도상구균 분리·동정 및 enterotoxin gene 검출실험 ... 29
    24. 2. 황색포도상구균 분리주의 주요 병원성인자 분석 ... 29
    25. 3. 유방염 분리균주의 병원성 인자 발현 분석 ... 29
    26. 4. 유전자 재조합 Cytotoxin 제작 ... 29
    27. 5. 유전자 재조합 비병원성 장독소 제작 ... 30
    28. 6. 표준균주 분석을 통한 황색포도상구균 분리주의 주요 병원성인자 선발 ... 30
    29. 7. 한국형 유방염 표준균주의 Knock-out 약독화 균주 제작 및 병원성 확인 시험 ... 30
    30. 8. 한국형 유방염 표균균체 선발 ... 30
    31. 9. 백신 개발을 위한 유전자 재조합 단백질 제작 ... 31
    32. 10. 비병원성 장독소 및 세포독소 혼합백신의 유효성 검증 ... 31
    33. Ⅴ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 32
    34. Ⅵ. 참고자료 ... 32
    35. Ⅶ. 영문초록 ... 36
    36. 끝페이지 ... 36
  • 참고문헌

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