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PRRSV 구조단백질 에피토프 이용 혈청학적 진단법 및 유전자 백신 개발 기초 연구
Basic research to develop efficacious DNA/vector vaccine and sero-diagnostic assay using protection correlate or discorrelate epitopes defined in major PRRSV structural proteins

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    PRRSV 구조단백질 에피토프 이용 혈청학적 진단법 및 유전자 백신 개발 기초 연구

  • 주관연구기관

    농림축산검역본부
    Animal and Plant Quarantine Agency

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-12

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000722

  • 과제고유번호

    1545009006

  • 키워드

    구조단백질.에피토프.유전자 백신.PRRSV.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • DOI

    https://doi.org/10.23000/TRKO201600000722

  • 초록 


    ...


    5. 최종 연구결과 요약

    제1세부과제와 제 2세부과제 연구내용을 예방과 진단의 카테고리로 재배열하여 연구결과를 요약 기술하였음

    <예방>
    ◆태반감염된 자돈에서의 PRRS병증형성과 면역형성과의 관계구명...

    5. 최종 연구결과 요약

    제1세부과제와 제 2세부과제 연구내용을 예방과 진단의 카테고리로 재배열하여 연구결과를 요약 기술하였음

    <예방>
    ◆태반감염된 자돈에서의 PRRS병증형성과 면역형성과의 관계구명
    - 모돈의 SLA type을 결정하였고, 자돈으로부터 1~14일령까지 바이러스혈증, 중화역가, 조직내 바이러스 양, 혈액내 T세포 양, 바이러스감염 폐포세포 양 및 폐의 병변을 검사하였음
    - 중화항체가 혹은 T세포와 폐병변, 혈액 혹은 조직내의 바이러스양과 폐병변 혹은 폐포감염세포 양은 비례관계를 분석한 결과, T 세포 양과 PRRS 병변이 역 비례하였음
    - 따라서, PRRS 바이러스에 대한 방어 면역은 중화항체가 보다는 세포면역이 큰 역할을 하는 것으로 분석되었음
    ◆PRRS 바이러스에 감염된 돼지폐포 대식세포에서의 MHC class I, MHC class II 단백질 발현에의 영향분석
    - PAM세포에 바이러스를 감염시킨 후, MHC class I과 MHC class II 단백질의 발현을 FACS로 분석하였다.
    - 분석결과, 바이러스에 감염된 PAM세포는 SWC3발현이 현저히 낮았고(92%감소), MHC class I 및 II의 발현에는 큰영향을 주지 않았음 (21~32.7% 감소)
    - 따라서, PRRS 바이러스 감염시 세포면역이 바이러스 감염주기의 초기부터 후기까지 지속적으로 중요한 방어기전으로 역할을 할 것으로 보임
    ◆PRRSV 세포면역관련 T세포 에피토프 탐색 및 선발
    - PRRS바이러스 전체유전자 분석을 통해 T세포 에피토프 663개를 제작하였음
    - IFN-r ELIspot법을 이용하여 PRRSV 특이 세포면역반응을 유도하는 항원결정기가 존재하는 여부를 분석한 결과, 구조단백질 (M, GP4, GP5)내에 에피토프가 면역원성이 탁월 하였음
    ◆기초연구물질 작성
    ∘ Immortalized Cell line 제작
    - T 세포의 활성분석에 활용될 표적세포를 만들기위해, hTERT lentivirus를 제작하여 B 세포 및 MDM 세포에 감염시켜 불사계화 세포주를 작성 시도하였으나, 성공하지 못하였다. 그 외, EBV를 이용하여 같은시도를 하였으나, 세포주를 얻지 못했음
    ∘ T세포 자극에 사용할 사이토카인 발현 및 조건확립
    - Monocyte를 PRRSV의 감염 Target 세포인 monocyte derived macrophage로 분화시킬 돼지유래 GM-CSF 및 T 세포를 활성화시킬 돼지유래 IL-2, IL-7를 E.coli에서 발현하였다. 발현된 단백질의 자극 혹은 분화 효과를 T세포 및 Monocyte에서 FACS로 분석한 결과, 효과가 충분하지 않았음.

    <진단>
    ◆국내유행 PRRSV 분리, 유전형 및 glycan type 분석
    - 국내유행분리 139주 (60 EU type, 79 NA type)에 대하여 ORF5 유전자의 염기서열을 분석하였음
    - 아미노산 염기서열은 NA 및 EU 분리주가 VR2332 및 Lelystad와 각각 83~97%, 81~90%의 상동성은 보였고, glycan type은 NA type의 경우 NA3 (34,44,51), EU type의 경우 EU3 (37, 46, 53)가 주요 glycan type으로 나타났음
    - Phylogenetic assay의 결과, 국내분리주는 대부분 국외분리주와는 유전자적 특이성을 가지고 있어, 국내분리주의 진화를 양상을 나타냈음
    ◆PRRSV 구조단백질 중화항체 에피토프 선발 및 특성분석
    - 다양한 야외분리주 항체와 반응하는 바이러스 주 (VR2332, 14003, 1403-2, LV)를 선정하였음
    - 이 바이러스를 증폭, 농축시켰고, 디 글리코실레이션한 바이러스와 농축시킨 생바이러스를 항원으로하여 단클론항체를 생산시도하여, 최종 312주의 항체를 생산하였고, 그 중 3개주의 NA type 유래 high affinity 항체, 15개주의 EU type 유래 high affinity항체 생산하였음
    ◆특이성 및 효율성이 개선된 PRRSV 항체 진단법 개발
    - 알려진 PRRSV 비중화 에피토프와 EU 및 NA type N protein을 이용하여 진단법 활용을 위한 2종의 단백질을 E.coli에서 생산하였음
    - 생산된 항원 및 PRRSV 표준 항혈청을 이용하여 ELISA법에서의 활용성을 검토한 결과, 진단법개발이 가능한 것으로 분석되었음


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 7
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 8
    8. 1. ...
    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 7
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 8
    8. 1. 재 료 ... 8
    9. 2. 연구전략 및 방법 ... 8
    10. Ⅲ. 연구결과 ... 10
    11. 1. 제1세부과제명 : PRRSV 구조단백질 내 중화 epitope 규명 및 conserved epitope인식 항체 선발 ... 10
    12. 2. 제2세부과제명 : PRRSV epitope cluster를 삽입한 DNA 백신 카세트 최적화 및adjuvant 개발 ... 26
    13. Ⅳ. 연구결과 및 요약 ... 38
    14. Ⅴ. 금후 추진계획 ... 38
    15. Ⅵ. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 38
    16. Ⅶ. 참고자료 ... 39
    17. 끝페이지 ... 41
  • 참고문헌

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