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보고서 상세정보

국내 사슴만성소모성질병 발생 특성 분석
Studies on cervine CWD cases and soil contamination in 2010

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    국내 사슴만성소모성질병 발생 특성 분석에 관한 연구

  • 주관연구기관

    농림축산검역본부
    Animal and Plant Quarantine Agency

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-12

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000733

  • 과제고유번호

    1545008994

  • 키워드

    형질전환마우스.특성분석.토양전파.CWD.PMCA.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • DOI

    https://doi.org/10.23000/TRKO201600000733

  • 초록 


    ...


    5. 최종 연구결과 요약
    세부과제명: 국내 사슴 품종별 사슴만성소모성질병 발생건 특성 분석 및 병원성 조사
    - 2010년 국내 CWD발생 19건(엘크 6두, 레드디어 1두, 꽃사슴 7두, 레드디어와 꽃사슴의 교잡종 5두)...

    5. 최종 연구결과 요약
    세부과제명: 국내 사슴 품종별 사슴만성소모성질병 발생건 특성 분석 및 병원성 조사
    - 2010년 국내 CWD발생 19건(엘크 6두, 레드디어 1두, 꽃사슴 7두, 레드디어와 꽃사슴의 교잡종 5두)에 대한 변형프리온의 분포를 병리학적으로 조사한 결과, 빗장부위의 immunolabelling score가 높을수록 뇌 전체에 변형프리온이 분포함. 인두후림프절에 변형프리온이 검출될 경우, 편도에도 양성반응이 확인됨.
    - 2010년 CWD 발생건(빗장부위의 IHC)에 대한 immunolabelling patern 분석 결과, 전반적으로 perineuronal pattern이였으며 잠복기 초기에는 granular pattern이, 질병이 진행될수록 punctate와 coalescing pattern이 관찰됨. 꽃사슴 7마리 중 5마리에서 glial pattern이 관찰되었으나 품종간 특이 패턴은 관찰되지 않음.
    - 엘크프리온 단백질을 과발현한 형질전환 마우스(TgElk)에 2010년 국내 발생 사슴 품종별 조직(10% 뇌 및 인두후림프절 유제액)을 뇌내 접종하여 bioassay를 실시하였으며 3차 계대를 완료하여 품종별(엘크, 레드디어, 꽃사슴, 교잡종) 발생 CWD에 대한 마우스 순화 strain을 확보함.
    - 조직유제액(뇌, 인두후림프절)에 대한 항원 ELISA OD값에 따라 잠복기를 초기, 중기, 말기로 분류한 결과, 엘크는 초기, 중기, 말기로, 교잡종은 중기, 말기로, 꽃사슴과 레드디어는 말기로 분류되었음. 이들 유제액을 이용하여 TgElk에 계대하였으며, 마우스간 계대를 통해 순화시켰음.
    - 질병의 진행이 중기인 경우, 뇌에 비해 림프절이 항원 OD값이 높게 나타났으며, 말기로 갈수록 뇌의 OD값이 높게 나타남을 알 수 있었음. 엘크는 OD값이 0.030이하인 3개체의 림프절에 대한 바이오에세이 결과, 1차 계대 시에는 잠복기가 196±38일, 239±19일, 173±33일로 나타났으나, 3차 계대 시에는 각각 112±11일, 108±13일, 121±22일로 유의성 있게 단축되었음. 또한, 림프절의 유제액에 대한 1차 생존기간을 비교한 결과에서도 OD값에 따른 즉, 항원양에 따라, 기간이 단축됨을 알 수 있었음. 교잡종, 꽃사슴, 레드디어의 경우에도, 양적 의존도에 따라 잠복기별 차이가 나타남을 확인하였으며, 품종에 상관없이 TgElk에 잘 순화되었음.
    - CWD 특성분석(strain characterization)을 위해 TgElk에 대한 lesion profiling, 사슴과 TgElk에 대한 생화학적 분석(WB pattern, PK 감수성, deglycosylation assay, conformational stability assay), TgElk의 잠복기를 CWD 감염 사슴 품종별로 비교 분석하였음.
    - Lesion profiling은 CWD에 감염된 사슴 품종에 대해 정량적 개념을 도입, 항원 OD값이 유사하게 뇌유제액을 희석하여 마우스 바이오에세이(1~3차 계대)를 실시하고 뇌의 공포수에 따른 스코어를 토대로 작성하였음. 그 결과, 모든 품종(엘크, 교잡종, 꽃사슴, 레드디어)에서는 G3(superior colliculus)와 G7(septal nuclei of the paraterminal body)에 가장 높은 공포수를 보였음. 이는 캐나다 CWD 분리주에 대한 Tg 마우스 결과와 유사하였음. WB pattern은 diglycosylated>monoglycosylated>unglycosylated band의 순으로 density의 차이가 있고 사슴 품종 및 마우스간 차이는 관찰되지 않았음. 또한, 기타 생화학적 분석 패턴의 경우에도 유사한 성상이 관찰되었으며 교잡종의 경우, PK 감수성이, 꽃사슴과 꽃사슴 CWD 유래 TgElk는 다른 종에 비해 conformational stability가 다소 높았음. 그 외 차이는 관찰되지 않았음.
    - GFAP(별아교세포 지표) 및 PrPCWD와의 면역병리학적 연관성 분석 결과, 변형프리온이 분포한 부위에서 GFAP가 더 많이 출현함을 알 수 있으나, 특이성 있는 연관성은 없었음.
    - 국내 발생 엘크 CWD에 대한 마우스 순화 strain을 확보하기 위하여 CWD발생 사슴뇌유제액을 VM 마우스에 접종하였음. 1차 계대 시, 1마리(657일)에서 CWD가 증폭되었음을 확인하였고 VM 마우스에 2차, 3차로 뇌 내 접종한 결과, 100% 감염율을 보였으며, 잠복기는 355±30일, 321±23일로 유의성 있는 감소를 보였음. 현재 4차 계대가 진행 중에 있음.
    - 세포유래 PrPCWD의 확보를 위해 프리온단백질에 감수성이 있는 엘크프리온이 발현된 rabbit kidney cell에 품종별 CWD감염 뇌유제액을 접종하여, 감염세포의 확립을 확인하였으나, 지속적으로 계대가 진행되지 않았음. 추가적인 실험을 진행할 수 없었음.
    세부과제명: 토양에서 사슴만성소모성질병(CWD) 특성에 관한 연구
    - 토양의 준비는 감염농장과 유사한 환경을 설정(5㎝ 깊이 토양선택: 발굽으로 팔 수 있는 깊이)하기 위해 24시간동안 물로 수화한 토양과 건조한 토양을 준비하였음. 평균 임상증상 지속기간을 감안하여 4개월간 토양과 CWD 감염 뇌조직(1%, 0.1%, 0.01%, 0.001%)을 반응시켰음. 시료는 변형프리온의 검출차이를 보기 위해 1개월간마다 준비하였으나, 1~3개월간의 차이는 관찰되지 않아, 1개월과 4개월 간격으로 토양과 감염뇌조직의 PrPCWD를 결합시켰음.
    - 확보된 토양에서 변형프리온을 추출한 결과, 1%, 0.1%, 0.01% 감염 뇌조직으로 결합시킨 토양(spiked soil)에서 변형프리온이 검출됨을 확인하였음. 현재 PMCA기법을 spiked soil에 적용하여 0.001%까지 변형프리온이 검출됨을 확인함.
    - Spiked soil의 감염력을 확인하기 위해 형질전환마우스에 감염실험을 실시하였음. 음성대조군 모두에서는 변형프리온이 확인되지 않았으며, 수화한 0.001~1% spiked soil 접종군(1개월, 4개월)에서는 모두 감염력을 회복하였음. 또한 건조한 0.1~1% spiked soil의 경우에도 모두 감염력을 확인하였음.
    - 국내 양성농장과 유사한 설정을 위해 추가적 실험은 수화한 0.01%, 0.001% spiked soil에 대해 마우스 접종 실험한 결과, 폐사된 개체에서는 모두 감염력이 확인되었으며 일부 실험은 진행 중에 있음. 1%, 0.1%, 0.01% spiked soil 접종군의 잠복기는 1개월군에서는 각각 162±48일(최초 폐사일: 114일), 173±27일 (146일), 182±25일(164일)이였으며, 4개월군의 경우는 134±45일(126일), 175±64일(109일), 171±37일 (134일)로 나타났음. 0.001% 접종군은 현재 실험이 진행 중에 있으나, 1개월군에서 206일에, 4개월군에서는 148일에 최초 폐사가 나타났으며 모두 감염력이 회복되었음.
    - CWD 양성 농장의 토양을 형질전환 마우스에 뇌내 접종하여 100일 간격으로 순차적으로 도태시켜 감염여부를 확인하였음. 접종 200일째 1두의 마우스에서 변형프리온이 검출되었으나, 300일, 400일까지 관찰한 결과, 변형프리온은 검출되지 않았음.
    - CWD 오염 토양에서의 변형프리온 억제를 위해 소독제인 2% 하라솔, 2N NaOH을 사용하여 실험하였음. 그 결과, 1시간과 16시간동안 2N NaOH로 처리한 시료에서 PrPCWD가 완전히 억제됨을 알 수 있었으나, 그 외 소독제인 2% 하라솔은 16시간 반응시켜야 PrPCWD가 억제되었음.


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 8
    8. 1. ...
    1. 표지 ... 1
    2. 농림축산검역검사기술개발 연구과제 최종결과보고서 ... 2
    3. Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 5
    4. 1. 연구배경 ... 5
    5. 2. 연구최종목표 ... 6
    6. 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 7
    7. Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 8
    8. 1. 재 료 ... 8
    9. 2. 연구전략 및 방법 ... 9
    10. Ⅲ. 연구결과 ... 11
    11. 가. 제1세부과제명 : 국내 사슴 품종별 사슴만성소모성질병 발생건 특성분석 및 병원성 조사 ... 11
    12. 나. 제2세부과제명 : 토양에서 사슴만성소모성질병(CWD) 특성에 관한 연구 ... 27
    13. Ⅳ. 연구결과요약 ... 36
    14. 1. 제1세부과제명 : 국내 사슴 품종별 사슴만성소모성질병 발생건 특성 분석 및 병원성 조사 ... 36
    15. 2. 제2세부과제명 : 토양에서 사슴만성소모성질병(CWD) 특성에 관한 연구 ... 37
    16. V. 고찰 ... 38
    17. VI. 연구결과 활용실적 및 계획 ... 40
    18. VII. 참고자료 ... 41
    19. 끝페이지 ... 42
  • 참고문헌

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