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보고서 상세정보

식육 및 식육부산물에서 시가독소원성 대장균의 신속 고효율 분리·동정기법 개발
Development of a rapid and highly efficient method for isolation and identification of STEC from meats and meat byproducts

  • 사업명

    농림축산검역검사기술개발

  • 과제명

    식육 및 식육부산물에서 시가독소원성 대장균의 신속 고효율 분리·동정기법 개발

  • 주관연구기관

    서울대학교 산학협력단

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2014-11

  • 과제시작년도

    2014

  • 주관부처

    농림축산식품부
    Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs(MAFRA)

  • 등록번호

    TRKO201600000753

  • 과제고유번호

    1545008889

  • 키워드

    시가독소원성 대장균.신속 균 동정.식육.식육부산물.Shiga-toxigenic E. coli.Rapid isolation.Meats.Meat byproducts.

  • DB 구축일자

    2016-04-30

  • DOI

    https://doi.org/10.23000/TRKO201600000753

  • 초록 


    One of the continuous problems on the farms and dairy industries is the isolation and identification of various STEC serotypes b...

    One of the continuous problems on the farms and dairy industries is the isolation and identification of various STEC serotypes because no distinctive biochemical and genetic criteria have been reported. Therefore, the study was performed to develop a rapid and efficient immuno-magnetic separation technique for STEC as well as to investigate the prevalence and virulence characteristics of STEC isolates from retail meats and meat by-products in Korea. As a result, we selected the five biomarkers specific for STEC, including Stx1 & 2, ECP, intimin, and Saa adhesin, and constructed the monoclonal antibodies against four biomakers after over-expression and purification of the individual recombinant biomarker antigens. For maximal conjugation of those antibodies with magnetic beads, we determined the optimal conditions and concetrations of antibodies (20~25ug/bead) and further evaluated with various Gram-postivie and –negative enteric bacteria in terms of specificity and sensitivity. We investigated the prevalence of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) among the 437 retailed meats and meat by-product from markets and slaughter houses in Seoul, Gyeonggi, Gangwon and Chungcheong provinces. A total of 7 (1.6%; 7/437 samples) STEC isolates and 3 (0.7%; 3/437) Salmonella species were isolated. Our experimental analyses revealed that seven STEC isolates belonged into the 4 different serotypes including O91:H14 (3 isolates), O121:H10 (2), O91:H21 (1), and Ont:H20 (1). Determination of the 8 major virulence genes (stx1 &2, saa, ecp, eae, tir, espB, and ehxA) by the PCR analyses demonstrated that none carried the eae, tir, and espB genes, indicating the absence of the LEE pathogenicity island in these STEC isolates (previously defined as LEE-negative STEC). The plasmid profiling demonstrated that the 4 STEC isolates harbor the 60-megadalton virulence plasmid. Although we did not find any functional variations in the individual DNA and/or amino acid sequences, the two STEC O121:H10 isolates were not express the rpoS (encoding the stationary sigma factor) gene product. Similarly, two out of the three STEC O91:H14 isolates were non-motile although they had the functional copies of the fliC gene (encoding the flagellin). In addition, our STEC isolates were highly susceptible to the antimicrobials evaluated in this study, but some isolates were resistant against tetracycline and/or ampicillin. Interestingly, further PFGE analysis demonstrated that the two STEC O91:H14 isolates (a single motile vs. a non-motile strains) were identified as the dame clonal set of STEC by PFGE analysis. Taken together, our present study imply that there are the unique pathogenic potentials as well as the existence of genetic correlation among the domestic STEC isolates Korea.


    다양한 STEC 혈청형의 존재 및 일반 대장균과 생화학적 특성의 유사성에 기인한 균 분리·동정의 어려움이 농·축산 현장에서 지속적으로 문제시 되고 있는 바, 본 연구과제는 자성나노입자를 기반으로 하는 STEC 신속 고효율 균 분리·...

    다양한 STEC 혈청형의 존재 및 일반 대장균과 생화학적 특성의 유사성에 기인한 균 분리·동정의 어려움이 농·축산 현장에서 지속적으로 문제시 되고 있는 바, 본 연구과제는 자성나노입자를 기반으로 하는 STEC 신속 고효율 균 분리·동정기법 및 검출 프로토콜을 개발함은 물론, 국내에서 식육 및 식육부산물에 존재하는 STEC의 분포양상 및 분리균주의 다양한 분자미생물학적 특성을 조사하고자 하였다. 연구수행결과로서, 총 5종의 STEC 특이 바이오마커(Stx1 & 2, ECP, intimin, Saa adhesin)를 선발하였고, 그 중 4종의 재조합항원 발현균주를 구축하여 과발현 및 정제한 뒤 개별 항원 특이 단클론항체를 제작하였다. 제작한 단클론항체를 자성나노복합체에 결합하기 위하여, 최적화 농도(20~25ug/bead) 를 결정하였으며, STEC O157:H7 표준균주를 포함하여 다양한 그람양성 및 그람음성 식중독 균주들에 대한 특이도 및 민감도를 조사하였다. 또한, 시가독소의 발현을 최적화할 수 있는 새로운 배양 배지 조건을 확립하고 식육에 적용함으로써, 6시간 전(前)배양 과정을 포함하는 검출 프로토콜을 제시하였다. 서울, 경기, 강원, 충청지역의 마켓 및 도축장 인근 식육가공장 유래 식육 총 437건의 시료로부터 STEC 분포율을 조사하였던바, 총 7주의 STEC 분리균주(시료 대비 1.6%)와 3종의 살모넬라균종(시료대비 0.7%)을 분리하였다. 이들 7종의 STEC 분리균의 혈청형 분석 결과, O91:H14(3종), O121:H10(2종), O91:H21(1종), Ont:H20(1종)으로 동정되었으며, 8종의 주요 병원성인자 유전자인 stx1 & 2, saa, ecp, eae, tir, espB, ehxA에 대한 PCR 분석 결과, 모든 STEC 분리균주가 공통적으로 eae, tir, espB에 대한 PCR 음성을 나타내어 LEE-negative STEC 균주임이 확인되었다. Plasmid 패턴분석 결과, 4종의 STEC 균주에서 60-MDa 병원성 플라즈미드를 보유함을 확인하였으며, 2종의 STEC O121:H10 분리균주의 경우, stationary sigma factor로 알려진 rpoS 유전자를 발현하지 못하였고, DNA 및 아미노산 염기서열에서 기능적 변이를 확인하지 못하였다. 유사하게, STEC O91:H14 분리균주 3종 중 2개의 균주의 경우 fliC 유전자의 기능적 변이 없이, 운동성을 발휘하지 못함을 확인하였다. 또한 국내 STEC 분리균주의 경우, 일부 균주에서 Tetracycline 및 Ampicillin에 대한 내성을 보였으나, 상대적으로 항생제에 대한 감수성이 높게 관찰되었으며, STEC O91:H14 non-motile과 motile 균주에서 PFGE 상동성을 확인하였다. 본 연구의 결과는 국내 STEC 분리균주의 병인특성 및 유전적 상관성의 존재를 암시한다.


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 총괄 연구과제 요약 ... 2
    3. 연구결과보고서 요약문 ... 4
    4. Summary ... 5
    5. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 6
    6. 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 6
    7. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 9
    8. 1.3...
    1. 표지 ... 1
    2. 총괄 연구과제 요약 ... 2
    3. 연구결과보고서 요약문 ... 4
    4. Summary ... 5
    5. 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 6
    6. 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 6
    7. 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 9
    8. 1.3 국내·외 기술개발 현황 ... 10
    9. 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 15
    10. 2.1 식육 및 식육부산물에 적용 가능한 신속 고효율 STEC 분리·동정법 개발 및 검출프로토콜 확립 ... 15
    11. 2.2 개발 기술의 표준화 및 국내·외 기존 STEC 검출기법과의 비교 검증 ... 17
    12. 2.3 식육 및 식육부산물을 대상으로 확립된 기술 및 검출 프로토콜의 적용 및 국내STEC 분포양상 조사 ... 18
    13. 2.4 식육 및 식육부산물 유래 STEC 국내 분리균주의 특성 분석 ... 19
    14. 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 23
    15. ▣ 식육 및 식육부산물에 적용 가능한 신속 고효율 STEC 분리·동정기법 개발 및 검출 프로토콜 확립 ... 23
    16. ▣ 개발 기술의 표준화 및 국내·외 기존 STEC 검출기법과의 비교 검증 ... 29
    17. ▣ 개발 기술의 표준화 및 국내·외 기존 STEC 검출기법과의 비교 검증 ... 31
    18. ▣ 식육 및 식육부산물을 대상으로 확립된 기술 및 검출 프로토콜의 적용 및 국내 STEC 분포양상 조사 ... 32
    19. ▣ 식육 및 식육부산물 유래 STEC 국내 분리균주의 특성 분석 ... 33
    20. 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 37
    21. 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 38
    22. 5.1 활용성과 ... 38
    23. 5.2 활용계획 ... 39
    24. 제6장 기타 중요변경사항 ... 39
    25. 제7장 참고문헌 ... 39
    26. 제8장 첨부서류 ... 40
    27. 끝페이지 ... 40
  • 참고문헌

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