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보고서 상세정보

임상적용이 가능한 줄기세포의 혈관평활근 세포로의 분화조절
differentiation of human embryonic stem cells to smooth muscle cells

  • 과제명

    임상적용이 가능한 줄기세포의 혈관 평활근 세포로의 분화 조절

  • 주관연구기관

    차의과학대학교

  • 연구책임자

    윤성지

  • 보고서유형

    최종보고서

  • 발행국가

    대한민국

  • 언어

    한국어

  • 발행년월

    2015-09

  • 과제시작년도

    2015

  • 주관부처

    교육과학기술부

  • 사업 관리 기관

    한국연구재단

  • 등록번호

    TRKO201600001228

  • 과제고유번호

    1345236502

  • 키워드

    혈관 평활근 세포hESCs,smooth muscle cell,NCSCs,PKC,differentiation

  • DB 구축일자

    2016-05-14

  • 초록 


    Purpose& contents
    In this study, after being differentiated to Neural crest stem cells (NCSCs) from hESCs, in the process of d...

    Purpose& contents
    In this study, after being differentiated to Neural crest stem cells (NCSCs) from hESCs, in the process of differentiating the smooth muscle cell, and developed a method of removing an animal-derived material to clinically access and signaling mechanisms. We want to advance the experiment at the center of the PKC signal pathway. Find the PKC isotype capable of inducing the differentiation of hESCs in NCSCs out the features and sub-signaling pathway of the protein find a key signal molecule. Enhanced efficiency NCSCs differentiation and then when to differentiate into smooth muscle cell is not a matter of FBS of animal origin. Block the differentiation of the unwanted tissue increases the efficiency of differentiation obtained a large number of cells needed for therapy to a stable cell line can be supplied to a patient in need.

    Result
    In order to rule out animal-derived materials hESCs grown on the medium with human vitronectin coating the E8 dish. Treat each of the different PKC inhibitor on the basis of differentiation medium(ITS) to induce differentiation into NCSCs. Where it was confirmed that PKC inhibitor3 treat the progress is differentiated to NCSCs. To confirm the expression of the marker, one of NCSCs Sox1 was performed the FACs. Sox1 expression in PKC inhibitor3 was found to increase significantly. In addition, these two compounds are widely used in the SB and DM differentiation to current NCSCs. The SB+DM and PKC inhibitor3 on each treated hESCs after the NCSCs specific markers Sox1, Nestin, and Pax6 using immunofluorescence staining. PKC inhibitor3 was able to confirm that the SB+DM and equally to promote differentiation NCSC. After processing the PKC inhibitor3 using Real-Time PCR was confirmed that expression of mRNA of the Pax6 and Sox1.Where treated with PKC inhibitor3 it was confirmed that the mRNA expression of the Pax6 and Sox1 is significantly increased. Finally, treatment the PKC activator in hESCs was confirmed that Pax6 is reduced. Among other PKC isotype seen as one of the isotype is inhibited by PKC inhibitor3 was found to play an important role in NCSCs to differentiate.

    Expected Contribution
    In a study on the method of hESCs differentiate into vascular smooth muscle cells,but little progress stayed in most of the steps formed in the academic laboratories. Therefore, substantial clinical way certain mechanisms that can be applied and hence were not required to be connected to the patient needs treatment not been revealed.However, the first attempt to study the hESCs to differentiate into vascular smooth muscle cells sikineunde develop technologies that enable the clinical use in less time than the currently reported. The results have not been not finished yet, the current differentiation to NCSCs the intermediate in a manner that excluded the animal-derived substance is complete, appears to be possible to be used as a development treatment is complete, if the differentiation experiment Mechanisms of smooth muscle cells.


    연구의 목적 및 내용
    본 연구는 hESCs에서 Neural crest stem cells (NCSCs)로 분화를 시킨 뒤 혈관 평활근세포로 분화시키는 과정에 임상적으로 접근이 가능 하도록 동물유래 물질을 없애는 방법을 개발하고...

    연구의 목적 및 내용
    본 연구는 hESCs에서 Neural crest stem cells (NCSCs)로 분화를 시킨 뒤 혈관 평활근세포로 분화시키는 과정에 임상적으로 접근이 가능 하도록 동물유래 물질을 없애는 방법을 개발하고 신호전달 기전을 밝히는 것을 PKC signal pathway를 중심으로 실험을 진행하고자 한다. 여러 PKC isotype중 NCSCs로의 분화를 유도 하거나 막을 수 있는 특정 isotype을 찾아내고 그 단백질의 기능과 정확한 하위 신호전달 체계를 밝혀 중요한 signal molecule을 찾아낸 뒤 hESCs을 NCSCs로 분화의 효율을 더욱 높이고 또한 혈관 평활근 세포로 분화시에도 동물유래의 물질인 FBS를 쓰지 않는 방식으로 분화 효율을 높이고 원치 않은 조직으로의 분화를 막아 치료에 필요한 많은 수의 세포주를 얻어 필요로 하는 환자에게 안정적인 세포주를 공급할 수 있도록 하고자 한다.

    연구결과
    hESCs을 동물유래 물질을 배제하기 위해 E8배지와 human vitronectin coating된 dish에 키우고, 분화를 진행하기 위해서 기초 분화배지(ITS)에 PKC의 inhibitor들을 treat하여 NCSCs로 분화를 유도하였는데 PKC inhibitor3에서 NCSC로 분화가 진행되는 것을 확인하였다. 이것을 FACs를 이용하여 NCSCs 분화마커중 하나인 Sox1의 발현을 확인해 보았는데 PKC inhibitor3에서 확연히 증가하는 것을 알 수 있었다. 또한 현재 NCSCs로의 분화에 두 가지 화합물인 SB와 DM이 많이 사용되고 있다. hESCs에 SB+DM과 PKC inhibitor3을 각각 처리한 뒤에 NCSCs 특이적인 마커인 Sox1, Nestin, Pax6으로 면역형광염색법을 이용하여 염색하였을 때 PKC inhibitor3만 처리 했을 때에도 SB+DM과 동등하게 NCSC로 분화가 촉진 된다는 것을 확인 할 수 있었다. ITS 만 처리한 것과 ITS에 PKC inhibitor3를 같이 처리한 뒤 Real-Time PCR을 이용하여 Pax6와 Sox1의 mRNA의 발현을 비교하였을 때 PKC inhibitor3를 같이 처리한 곳에서 Pax6와 Sox1의 mRNA발현이 현저히 증가되어 있음을 확인할 수 있었다. 마지막으로 PKC activator를 처리하였을때 Pax6가 감소하는 것을 확인하였다. 이것으로 보아 여러 PKC isotype중 PKC inhibitor3에 의해 억제되는 isotype중 하나가 NCSCs로의 분화에 중요한 역할을 한다는것을 알 수 있었다.

    연구결과의 활용계획
    지금까지 hESCs에서 혈관 평활근세포로 분화시키는 방법에 대한연구는 조금씩 진행되었으나 대부분이 실험실 내에서 이루어지는 학문적 단계에 머물러 있었다. 따라서 실질적으로 필요한 임상적용이 가능한 방법과 그에 따른 확실한 기전은 밝혀지지 않아 환자에게 필요한 치료로 연결되지 못 하였다. 하지만 이번 연구로 hESCs을 혈관평활근세포로 분화시키는데 현재 보고되어진 것 보다 적은 시간으로 임상적 사용이 가능하도록 하는 기술을 개발하기 위한 첫 시도이다. 실험결과가 아직 마무리가 되지 못했지만 현재 동물유래물질을 배제하는 방법으로 중간단계인 NCSCs로의 분화는 완료되어 평활근세포의 분화 실험기전연구가 완료된다면 치료법 개발로 활용가능 할 것 으로 보인다.


  • 목차(Contents) 

    1. 표지 ... 1
    2. 일반연구자지원사업 최종보고서 양식 ... 2
    3. 목차 ... 4
    4. 연구 계획 요약문 ... 5
    5. 연구 결과 요약문 ... 6
    6. 한글요약문 ... 6
    7. SUMMARY ... 7
    8. 연구내용 및 결과 ... 8
    9. 1. 연구개발과제의 개요 .....
    1. 표지 ... 1
    2. 일반연구자지원사업 최종보고서 양식 ... 2
    3. 목차 ... 4
    4. 연구 계획 요약문 ... 5
    5. 연구 결과 요약문 ... 6
    6. 한글요약문 ... 6
    7. SUMMARY ... 7
    8. 연구내용 및 결과 ... 8
    9. 1. 연구개발과제의 개요 ... 8
    10. 2. 국내외 기술개발 현황 ... 8
    11. 3. 연구수행 내용 및 결과 ... 9
    12. 4. 목표 달성도 및 관련 분야에의 기여도 ... 14
    13. 5. 연구결과의 활용계획 ... 14
    14. 6. 연구과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 15
    15. 7. 주관연구책임자 대표적 연구 실적 ... 15
    16. 8. 참고문헌 ... 15
    17. 9. 연구성과 ... 17
    18. 10. 기타사항(중요 연구 변경사항 등) ... 17
    19. 끝페이지 ... 18
  • 참고문헌

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